雙靶向融合蛋白增強(qiáng)腎癌腺病毒疫苗免疫活性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:如何靶向樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic Cells,DCs)提高免疫治療效果是當(dāng)前惡性腫瘤治療性疫苗領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。5型腺病毒載體疫苗在體外的實(shí)驗(yàn)中顯示出良好的感染效率,但在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中腺病毒疫苗特異性感染DCs的效率欠佳。因此,如何提高腺病毒體內(nèi)特異性靶向DCs能力,增強(qiáng)DCs的感染效率,發(fā)揮腺病毒疫苗治療腫瘤作用,需要進(jìn)一步探討與研究。
　　研究目的:利用分子生物學(xué)方法,制備一種能夠?qū)ο俨《竞虳Cs進(jìn)行雙靶向的蛋白分子

2、;使雙靶向融合蛋白一方面可以與腺病毒纖維頭節(jié)結(jié)合,另一方面可以與DCs表面分子DEC205結(jié)合,從而可以介導(dǎo)腺病毒疫苗靶向感染DCs,增強(qiáng)疫苗免疫效應(yīng)。
　　方法:
　　1.雙靶向融合蛋白的制備及活性鑒定:將5型腺病毒受體CAR的胞外段、噬菌體T4纖鏈蛋白以及抗小鼠DEC205單鏈抗體的基因序列拼接在一起,并進(jìn)行原核表達(dá)密碼子優(yōu)化;接著將優(yōu)化后的序列克隆至原核表達(dá)載體pGEX-6P-1中,構(gòu)建重組表達(dá)載體pGEX-CFmDE

3、C,并將該載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)可溶性重組蛋白;然后采用GST瓊脂糖凝膠純化重組蛋白并利用PreScission Protease切割GST標(biāo)簽,獲得雙靶向融合蛋白(CFmDEC)。純化后的雙靶向融合蛋白經(jīng)Western blot鑒定其特異性,并用ELISA、流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光等方法驗(yàn)證其生物學(xué)活性。
　　2.腎癌腺病毒疫苗的構(gòu)建及體外功能驗(yàn)證:將復(fù)合基因片段sig-tG250-Fc-GPI-IR

4、ES-GMCSF-B7.1(tG250FcGB)克隆至穿梭載體pDC316中,構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pDC316-tG250FcGB;利用AdMax腺病毒制備方法,將pDC316-tG250FcGB和腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGlox(delta)E1,3Cre在HEK293細(xì)胞內(nèi)重組,構(gòu)建可以表達(dá)G250融合抗原的腺病毒腎癌疫苗Ad5-tG250FcGB;然后,通過(guò)Western blot檢測(cè)分析Ad5-tG250FcGB在真核細(xì)胞中的表達(dá)情況。

5、r>　　3.CFmDEC協(xié)同Ad5-tG250FcGB抑瘤活性研究:最后,將腺病毒腎癌疫苗Ad5-tG250FcGB和 CFmDEC在體外結(jié)合后免疫小鼠。觀察CFmDEC和Ad5-tG250FcGB聯(lián)合免疫方式對(duì)小鼠腎細(xì)胞癌的抑制作用;同時(shí)利用ELISA法檢測(cè)免疫小鼠血清中的特異抗體滴度和脾淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的改變;采用LDH法體外檢測(cè)免疫小鼠細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng);以及用Elispot法檢測(cè)免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞特異性的IFN

6、-γ的分泌。
　　結(jié)果:
　　1.成功制備了雙靶向融合蛋白:通過(guò)雙酶切及測(cè)序鑒定成功構(gòu)建了pGEX-CFmDEC原核表達(dá)質(zhì)粒,Western blot檢測(cè)證實(shí)了pGEX-CFmDEC在大腸桿菌BL21(DE3)中正確表達(dá)了雙靶向融合蛋白CFmDEC;ELISA分析證明雙靶向融合蛋白在體外可以與其相應(yīng)的受體分子有效結(jié)合;流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光分析證實(shí)CFmDEC可以在體外增強(qiáng)腺病毒對(duì)DCs的感染能力。
　　2.成功構(gòu)建腎癌

7、腺病毒疫苗:通過(guò)雙酶切及測(cè)序鑒定成功構(gòu)建了穿梭質(zhì)粒pDC316-tG250FcGB;病毒基因組PCR及測(cè)序結(jié)果證實(shí)成功構(gòu)建了腎癌腺病毒疫苗Ad5-tG250FcGB;Ad5-tG250FcGB轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后,通過(guò)Western blot檢測(cè)分析證實(shí)腺病毒疫苗中的目的抗原基因能夠有效表達(dá)。
　　3.CFmDEC增強(qiáng)Ad5-tG250FcGB的免疫效應(yīng):Ad5-tG250FcGB和CFmDEC聯(lián)合免疫小鼠后,與對(duì)照組相比顯著抑制了腫

8、瘤的生長(zhǎng),小鼠生存時(shí)間延長(zhǎng)了7.2天;與單獨(dú)Ad5-tG250FcGB組比較,聯(lián)合疫苗組脾淋巴細(xì)胞分泌出更高水平的IFN-γ(412pg/mL)和IL-2(89.3pg/mL),聯(lián)合疫苗組的血清抗體IgG1/IgG2a比值與單獨(dú)疫苗組相比降低0.156,同時(shí)與單獨(dú)疫苗組相比對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效率增加了13％。
　　結(jié)論:雙靶向融合蛋白CFmDEC可以在體外有效結(jié)合腺病毒載體,提高腺病毒疫苗靶向DCs的能力,在小鼠體內(nèi)能夠誘導(dǎo)更強(qiáng)的特