攜帶IL-24雙調(diào)控條件增殖型腺病毒的構(gòu)建及其靶向治療腎癌體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：構(gòu)建Ki67啟動(dòng)子調(diào)控、缺失E1B55KD并攜帶治療基因IL24的條件增殖型腺病毒，研究其對(duì)腎癌的體外治療效果。
　　 方法：1．質(zhì)粒pKi67-ZD55-IL24、pKi67-ZD55-EGFP的構(gòu)建、酶切鑒定。
　　 2．將鑒定正確的質(zhì)粒分別與含有腺病毒的右臂質(zhì)粒pBHGE3共轉(zhuǎn)染低代293細(xì)胞，9～14d左右出現(xiàn)病毒空斑。病毒小量擴(kuò)增后提取重組腺病毒的DNA， PCR鑒定構(gòu)建的條件增殖型腺病毒Ki67-ZD5

2、5-IL24、Ki67-ZD55-EGFP。
　　 3．腺病毒鑒定正確后，對(duì)本次試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)所需要四種腺病毒ZD55-IL24、Ki67-IL24本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功構(gòu)建）進(jìn)行大量擴(kuò)增、純化和測(cè)定滴度。
　　 4．在10MOI、48h處理?xiàng)l件下，RT-PCR法檢測(cè)IL24在腎癌ACHN、786-O、KETR-3細(xì)胞及正常腎小管上皮細(xì)胞HK-2中的表達(dá)情況。
　　 5．在10MOI、48h處理?xiàng)l件下，Western Blo

3、t法檢測(cè)腺病毒E1A蛋白、IL24蛋白在腎癌ACHN、786-O、KETR-3細(xì)胞及正常腎小管上皮細(xì)胞HK-2的表達(dá)情況。
　　 6.West-8法檢測(cè)腺病毒對(duì)腎癌ACHN、786-O、KETR-3細(xì)胞及正常腎小管上皮細(xì)胞HK-2增殖的影響。
　　 7．結(jié)晶紫染色法檢測(cè)腺病毒對(duì)腎癌ACHN、786-O、KETR-3細(xì)胞及正常腎小管上皮細(xì)胞HK-2的細(xì)胞毒作用。
　　 結(jié)果：1．酶切鑒定左臂質(zhì)粒pKi67-ZD55

4、-IL24、pKi67-ZD55-EGFP及右臂質(zhì)粒pBHGE3正確。
　　 2.PCR鑒定表明重組腺病毒Ki67-ZD55-IL24、Ki67-ZD55-EGFP包含目的基因，且無(wú)野生型腺病毒污染。
　　 3．四種腺病毒大量擴(kuò)增后的滴度分別為：ZD55-IL24:3.26×109pfu/ml;Ki67-IL24:5.48x109pfu/ml;Ki67-ZD55-IL24:7.52×109pfu/ml;Ki67-ZD55

5、-EGFP:2.47×109pfu/ml。
　　 4.10MOI、48h處理?xiàng)l件下,RT-PCR檢測(cè)IL24mRNA發(fā)現(xiàn)：(1)在腎癌ACHN、786-O、KETR-3細(xì)胞中，僅ZD55-IL24、Ki67-IL24、Ki67-ZD55-IL24組表達(dá)IL24mRNA，其中ZD55-IL24組與Ki67-IL24組之間IL24mRNA表達(dá)量無(wú)明顯差異(P＞0.05),Ki-67-ZD55-IL24組IL24mRNA表達(dá)量較前兩組

6、多（P＜0.05）。(2)在HK-2細(xì)胞中未檢測(cè)到IL24mRNA的表達(dá)。
　　 5.10MOI、48h處理?xiàng)l件下，(1). Western blot檢測(cè)IL24蛋白發(fā)現(xiàn)：在腎癌ACHN、786-O、KETR-3細(xì)胞中，僅ZD55-IL24、Ki67-IL24、Ki67-ZD55-IL24組表達(dá)IL24蛋白，其中ZD55-IL24組與Ki67-IL24組之間IL24蛋白表達(dá)量無(wú)明顯差異（P＞0.05），Ki67-ZD55-IL2

7、4組IL24蛋白表達(dá)量較前兩組多（P＜0.05）;在HK-2細(xì)胞中未檢測(cè)到IL24蛋白的表達(dá)。(2). Western blot檢測(cè)E1A蛋白發(fā)現(xiàn)：在腎癌ACHN、786-O、KETR-3細(xì)胞中，四組病毒均表達(dá)表達(dá)E1A蛋白，其中Ki67-ZD55-IL-24組與K167-ZD55-EGFP組E1A蛋白表達(dá)量較ZD55-IL24組與Ki67-IL24組E1A蛋白表達(dá)量多（P＜0.05），而Ki67-ZD55-IL24組與Ki67-ZD5

8、5-EGFP組、ZD55-IL24組與Ki67-IL24組之間E1A蛋白表達(dá)量無(wú)明顯差異(P＞0.05)；在HK-2細(xì)胞中未檢測(cè)到E1A蛋白的表達(dá)。
　　 6．細(xì)胞活力檢測(cè)（West-8法）發(fā)現(xiàn)：(1).四種病毒對(duì)腎癌ACHN、786-O、KETR-3細(xì)胞增殖均有抑制作用且與病毒的濃度及感染時(shí)間存在正相關(guān)性，其中Ki67-ZD55-IL24組對(duì)腎癌細(xì)胞增殖的抑制作用最強(qiáng)（P＜0.05），ZD55-IL24組與Ki67-IL24組

9、對(duì)腎癌細(xì)胞增殖的抑制作用無(wú)明顯差異(P＞0.05),Ki67-ZD55-EGFP組對(duì)腎癌細(xì)胞增殖的抑制作用最弱（P＜0.05）。(2).四種病毒對(duì)HK-2細(xì)胞增殖無(wú)明顯抑制作用。
　　 7．結(jié)晶紫染色法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：(1).四種病毒對(duì)腎癌ACHN、786-O、KETR-3細(xì)胞均有殺傷作用且與病毒的濃度存在正相關(guān)性，其中Ki67-ZD55-IL24組對(duì)腎癌細(xì)胞的殺傷作用最強(qiáng)(P＜0.05),ZD55-IL24組與Ki67-IL24組對(duì)

10、腎癌細(xì)胞的殺傷作用無(wú)明顯差異（P＞0.05），Ki67-ZD55-EGFP組對(duì)腎癌細(xì)胞的殺傷作用最弱(P＜0.05)。(2).四種病毒對(duì)HK-2細(xì)胞無(wú)殺傷作用。
　　 結(jié)論：1．成功構(gòu)建條件增殖型腺病毒Ki67-ZD55-IL24、Ki67-ZD55-EGFP。
　　 2．條件增殖型腺病毒Ki67-ZD55-IL24可以在腎癌細(xì)胞中特異性表達(dá)，且對(duì)腎癌細(xì)胞的增殖具有較好的抑制作用，為腫瘤的生物治療提供了一個(gè)新的思路，為體