荷載Hep27的F5-35嵌合型纖毛選擇增殖腺病毒的構(gòu)建及其治療腎癌體外的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：構(gòu)建F5/35纖毛嵌合型、缺失E1B55KD并攜帶治療基因Hep27的條件增殖型腺病毒，研究其對(duì)腎癌的體外治療效果。
　　方法：1.腺病毒穿梭質(zhì)粒pCA13-Hep27和pZD55-Hep27構(gòu)建及鑒定。
　　2.將pZD55、pZD55-Hep27質(zhì)粒分別與5型腺病毒骨架質(zhì)粒pBGH10，pZD55、pZD55-Hep27、pZD55-EGFP質(zhì)粒分別與F5/35纖毛嵌合型腺病毒骨架質(zhì)粒pPE35共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)

2、胞，9～14d左右出現(xiàn)病毒空斑。病毒小量擴(kuò)增后提取重組腺病毒的DNA，PCR鑒定構(gòu)建的條件增殖型腺病毒Ad5-ZD55、Ad5-ZD55-Hep27、Ad5-ZD55-EGFP(實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建)、F5/35-ZD55、F5/35-ZD55-Hep27、F5/35-ZD55-EGFP。
　　3.對(duì)本次試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)所需要的腺病毒Ad5-ZD55、Ad5-ZD55-Hep27、Ad5-ZD55-EGFP、F5/35-ZD55、F5/35-Z

3、D55-Hep27、F5/35-ZD55-EGFP進(jìn)行大量擴(kuò)增、純化和測(cè)定滴度。
　　4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)Ad5-ZD55-EGFP和F5/35-ZD55-EGFP腺病毒對(duì)腎癌ACHN、786-O、OSRC細(xì)胞及正常腎小管上皮細(xì)胞HK-2的感染效率。
　　5.CCK-8法檢測(cè)腺病毒Ad5-ZD55、Ad5-ZD55-Hep27、F5/35-ZD55和F5/35-ZD55-Hep27對(duì)腎癌ACHN、786-O、OSRC細(xì)胞及正常

4、腎小管上皮細(xì)胞HK-2增殖的影響。
　　6.結(jié)晶紫染色法檢測(cè)上述四種腺病毒對(duì)腎癌ACHN、786-O、OSRC細(xì)胞及正常腎小管上皮細(xì)胞HK-2的細(xì)胞毒作用。
　　結(jié)果：1.酶切鑒定及測(cè)序證實(shí)質(zhì)粒pZD55-Hep27構(gòu)建正確。
　　2.六種腺病毒大量擴(kuò)增后的滴度分別為:Ad5-ZD55:1.26×108 pfu/ml;Ad5-ZD55-Hep27:1.9×109 pfu/ml;Ad5-ZD55-EGFP:1.25×10

5、9 pfu/ml;F5/35-ZD55:2.5×108 pfu/ml; F5/35-ZD55-Hep27:1.0×108 pfu/ml;F5/35-ZD55-EGFP:1.5×108 pfu/ml。
　　3.流式實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):Ad5-ZD55-EGFP、F5/35-ZD55-EGFP重組腺病毒感染腎癌ACHN、786-O、OSRC細(xì)胞及正常腎小管上皮HK-2細(xì)胞48h后，通過熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞中綠色熒光蛋白表達(dá)，結(jié)果顯

6、示F5/35-ZD55-EGFP腺病毒在腎癌細(xì)胞ACHN、786-O中的感染效率明顯增加，對(duì)腎癌細(xì)胞OSRC和正常腎小管上皮細(xì)胞HK-2中的感染效率較低。
　　4.CCK-8、結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)顯示四種病毒對(duì)腎癌ACHN、786-O細(xì)胞均有殺傷作用且能抑制其增殖，且CCK-8法顯示病毒對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用與病毒的濃度存在正相關(guān)性;在腎癌786-O、ACHN細(xì)胞中F5/35-ZD55-Hep27組的殺傷作用、增殖抑制作用最強(qiáng)，P＜0.0

7、5，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Ad5-ZD55-Hep27組及F5/35-ZD55組作用其次，兩組間無差異(P＞0.05); Ad5-ZD55組對(duì)腎癌細(xì)胞的殺傷、增殖抑制作用最弱，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在腎癌OSRC細(xì)胞中Ad5-ZD55-Hep27組對(duì)其殺傷、增殖抑制作用最強(qiáng)，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Ad5-ZD55組及F5/35-ZD55-Hep27組作用其次，兩組間無差異(P＞0.05);F5/35-ZD55組對(duì)腎癌細(xì)胞

8、的殺傷作用、增殖抑制作用最弱，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。四種病毒在低感染復(fù)數(shù)時(shí)對(duì)HK-2細(xì)胞均無明顯殺傷及增殖抑制作用作用。
　　結(jié)論：1.成功構(gòu)建條件增殖型腺病毒Ad5-ZD55、Ad5-ZD55-Hep27、F5/35-ZD55、F5/35-ZD55-Hep27、F5/35-ZD55-EGFP。
　　2.條件增殖型腺病毒F5/35-ZD55-Hep27可以在腎癌細(xì)胞中特異性表達(dá)，且對(duì)腎癌細(xì)胞的增殖具有較好的抑制作用