攜帶內(nèi)皮抑素基因增殖型腺病毒治療卵巢癌的實驗研究.pdf

1、卵巢癌是卵巢惡性腫瘤，是女性生殖器常見的三大惡性腫瘤之一。由于缺乏有效的早期診斷方法，診斷時多為晚期。死亡率居婦科惡性腫瘤首位。 腺病毒載體被廣泛應(yīng)用于基因治療和臨床試驗。然大多數(shù)腺病毒載體尚存在外源基因表達時間短、免疫原性較強、高滴度時有明顯的細胞毒性等缺點。腫瘤特異性增殖型腺病毒克服了上述腺病毒載體的不足，能夠靶向腫瘤細胞增殖，且病毒本身可殺死腫瘤細胞，而不損害正常細胞，從腫瘤細胞釋放出來的病毒可繼續(xù)感染周圍的腫瘤細胞，具有

2、療效放大作用。與傳統(tǒng)治療方法機制完全不同，一般不引起嚴重的毒副作用。其中增殖型腺病毒ONYX-015被認為是最為有效的腫瘤生物治療方案之一，ONYX-015是E1b55Kda蛋白編碼基因缺失的2型和5型腺病毒嵌合體，可在p53基因突變的腫瘤細胞內(nèi)特異性增殖而不影響正常細胞。p53抑癌基因是人體惡性實體瘤最常見的一種可突變基因，55％～80％的原發(fā)性卵巢癌可發(fā)現(xiàn)有p53的突變，ONYX-015已在卵巢癌的治療中實驗應(yīng)用。 通過新生

3、血管的生成滿足其不斷生長所需的豐富血供，是實體腫瘤一個重要特征，當(dāng)直徑超過2cm時其生長依賴于新生血管的形成，另外，新生血管生成在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中也起著決定性作用。卵巢癌富含血管，易發(fā)生腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移。抑制腫瘤新生血管生成已成為腫瘤治療的新方向。在已發(fā)現(xiàn)的幾種新生血管抑制劑中，以內(nèi)皮抑素(Endostatin)的作用最為明顯，內(nèi)皮抑素可顯著抑制體外血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞增殖、遷移和血管生成以及實驗動物實體腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移

4、，長期用藥并無免疫原性和耐藥性等問題發(fā)生，同時無論是在動物實驗還是在業(yè)已結(jié)束的Ⅰ期臨床試驗中都沒有明顯毒副作用。有資料表明卵巢癌組織內(nèi)的VEGF表達和微血管密度(MVD)與卵巢癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)，Hampl等已經(jīng)成功地應(yīng)用了腺病毒來源的鼠重組血管內(nèi)皮抑素、血管生長抑素等血管內(nèi)皮抑制因子，來治療種植鼠卵巢癌和乳腺癌所引起的腹膜轉(zhuǎn)移性癌和癌性腹水。 采用內(nèi)皮抑素純蛋白直接注射給藥法治療腫瘤所需劑量大，傳統(tǒng)生物工程方法

5、表達生產(chǎn)量低，體外活性難于保持，妨礙了內(nèi)皮抑素的臨床應(yīng)用?；蛑委煼椒ㄓ型鉀Q這一難題。通過增殖缺陷型腺病毒載體介導(dǎo)內(nèi)皮抑素基因治療方法在以往研究中已取得了一定效果。但由于對早期增殖缺陷型腺病毒載體的改造出于安全原因考慮，缺失了腺病毒復(fù)制所必需的大部分E1區(qū)基因，同時也就限制了其在腫瘤細胞內(nèi)的復(fù)制和治療基因的有效表達。因而一個高效的可持續(xù)高濃度表達治療基因的導(dǎo)入載體系統(tǒng)必將對充分發(fā)揮內(nèi)皮抑素抗腫瘤新生血管生成的治療有著深遠意義。同時必需

6、考慮盡可能不侵害正常細胞即基因治療的靶向性和安全性這一個關(guān)鍵問題。 腫瘤特異性溶瘤增殖病毒的出現(xiàn)為腫瘤基因治療提供了一條新思路。病毒攜帶的抗癌基因可隨病毒在腫瘤細胞內(nèi)的復(fù)制得到高效表達，在腫瘤原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶局部形成高濃度抗癌因子，兩者協(xié)同作用可進一步提高腫瘤的治療效果。為卵巢癌的病毒基因治療、抗新生血管生成基因治療提供新的思路。 方法和結(jié)果： 1.攜帶人內(nèi)皮抑素基因的增殖缺陷型及增殖型腺病毒載體的構(gòu)建和制備本研究

7、首先通過分子生物學(xué)技術(shù)，利用重疊PCR方法在hEndo基因片段的5’端引入M-成瘤蛋白信號肽序列，在其兩端分別生成EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位點后定向克隆入測序質(zhì)粒載體pBluescriptⅡSK中。測序鑒定正確的質(zhì)粒pBlue-hEndo以EcoRI和XbaI雙酶切后將5’端包含M-成瘤蛋白信號肽序列的hEndo基因定向克隆入增殖缺陷型腺病毒穿梭質(zhì)粒載體pCA13中。兩個BglⅡ位點之間為包含了CMV啟動子+人內(nèi)皮抑素基因+SV40po

8、lyA加尾信號的外源基因表達盒。質(zhì)粒pCA13-hEndo再以BglⅡ酶切后將包含了CMV啟動子+人內(nèi)皮抑素基因+SV40polyA加尾信號的表達盒克隆入增殖型腺病毒穿梭質(zhì)粒載體pXC7C中。 而后通過Lipofectamine2000方法將質(zhì)粒pCA13-hEndo、pXC7C-hEndo、pCA13-GFP及pXC7C-GFP與含有5型腺病毒右臂的骨架質(zhì)粒pBGHE3分別共轉(zhuǎn)染至293細胞，利用細胞內(nèi)同源重組方法獲得所需腺病

9、毒。經(jīng)三次病毒空斑純化，攜帶人內(nèi)皮抑素基因腺病毒DNA經(jīng)PCR進行鑒定，攜帶GFP基因的腺病毒在熒光顯微鏡下直接挑取克隆，正確克隆后分別命名為Ad-hE、CNHK200-hE(CK-hE)、Ad-GFP及CNHK200-GFP(CK-GFP)。 最后將腺病毒在293細胞中反復(fù)擴增到所需量，氯化銫密度梯度離心法純化獲得較高濃度的病毒懸液，TCID50法測得CK-hE、Ad-hE、CK-GFP及Ad-GFP病毒滴度分別為4×1010

10、pfu/ml，1×1011pfu/ml，3.8×1010pfu/ml和7.5×1010pfu/ml。 2.攜帶hEndo基因的增殖型腺病毒對卵巢癌的體外治療作用 本研究首先通過細胞病理效應(yīng)(CPE)的實驗觀察、比較CK-hE、Ad-hE和ONYX-015不同的MOI值分別感染L02、OV-90細胞株后對2種細胞殺傷能力差別。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與ONYX-015相比，1.2kb的hEndo基因片段的插入并未影響CK-hE對腫瘤細胞

11、的選擇性殺傷能力，在MOI=1時即可殺死全部腫瘤細胞，而對正常肝細胞L02的作用較弱。與上述兩種病毒相比，Ad-hE對L02的細胞病理效應(yīng)相似，但其對腫瘤細胞殺傷力與增殖型腺病毒相比則差3個數(shù)量級。MTT法分別量化測定各病毒對卵巢癌OV-90細胞殺傷作用的差異，結(jié)果表明在感染后第3天CK-hE和ONYX-015對OV-90細胞的殺傷率顯著高于Ad-hE(P＜0.01)，但CK-hE和ONYX-015二者之間無明顯差異(P＞0.05)。

12、 病毒增殖實驗則進一步闡明了三種病毒對不同細胞CPE效應(yīng)以及殺傷作用差異的機制。在L02中，三種病毒均不明顯增殖，病毒感染96小時后，最大增殖倍數(shù)僅為8.47倍；而在OV-90中，CK-hE和ONYX-015的增殖能力均強于Ad-hE，病毒感染96小時后增殖倍數(shù)達2000多倍，二者無顯著差異；而Ad-hE感染OV-90細胞96小時后僅增殖3.42倍。 通過蛋白印記分析(WesternBlot)證實CK-hE和Ad-hE感染

13、OV-90后在培養(yǎng)液上清中均可檢測到分子量約20kDa的hEndo，表明兩種腺病毒載體均可表達分泌型hEndo。通過ELISA定量檢測OV-90細胞感染兩種病毒后hEndo的表達量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨時間的延長，培養(yǎng)液中CK-hE的hEndo表達量不斷增加，增加趨勢同病毒的增殖趨勢相一致，在第5天時與同期的Ad-hE相比高出8倍以上。 通過雞胚絨毛尿囊膜(CAM)試驗表明：與標準品相比，CK-hE在卵巢癌細胞中表達的hEndo具有相似的

14、抗新生血管生成生物活性，同時也觀察到大量的病毒存在對正常血管也有一定影響。 利用攜帶GFP報告基因的增殖缺陷型和增殖型腺病毒感染L02細胞和OV-90細胞后能更直觀地說明二者在靶向性、目的基因表達量和腫瘤細胞CPE效應(yīng)方面的差異。Ad-GFP感染上述兩種細胞和CK-GFP感染L02細胞后熒光基本無變化；而CK-GFP感染OV-90細胞后熒光范圍不斷擴大，隨后出現(xiàn)中心區(qū)腫瘤細胞的死亡，熒光蛋白逐漸分解現(xiàn)象。 3.攜帶hEn

15、do基因的增殖型腺病毒對卵巢癌的體內(nèi)治療作用 使用BALB/c裸鼠皮下接種OV-90細胞后建立荷人卵巢癌動物模型后，瘤內(nèi)直接注射病毒治療。CK-hE治療組腫瘤生長緩慢，自治療開始后第14天起腫瘤體積已明顯小于Ad-hE治療組(P＜0.05)及PBS對照組(P＜0.01)，但沒有觀察到腫瘤消退或停止生長的理想治療結(jié)果。各項實驗進一步闡明了內(nèi)皮抑素和增殖病毒對卵巢癌協(xié)同治療作用的機理。 ELISA檢測表明：在裸鼠瘤內(nèi)單次注射

16、攜帶hEndo基因的腺腺病毒后均可在血清中檢測到內(nèi)皮抑素蛋白的表達，隨時間延長表達量逐漸升高，CK-hE治療組裸鼠體內(nèi)hEndo濃度始終高于Ad-hE治療組，且增長速度較快。第7天時CK-hE治療組小鼠血清內(nèi)皮抑素濃度(1897±196ng/ml)顯著高于Ad-hE治療組(637±121ng/ml)(P＜0.05)。 血管內(nèi)皮細胞vWF因子免疫組化染色提示CK-hE治療組腫瘤組織中的微血管數(shù)量較ONYX-015治療組明顯減少。

17、 在腺病毒外殼蛋白中的五鄰體(Hexon)免疫組化染色發(fā)現(xiàn)CK-hE治療組腫瘤組織存在大量陽性細胞，通過電鏡下觀察見腫瘤細胞核內(nèi)有病毒晶格形成以及細胞裂解死亡前超微結(jié)構(gòu)的改變，表明增殖型腺病毒可在腫瘤細胞內(nèi)復(fù)制、增殖，同時具有直接裂解腫瘤細胞的治療作用以及可增加病毒載體數(shù)量，具有療效的放大作用。 結(jié)論： 本研究通過對攜帶hEndo基因的增殖缺陷型和增殖型腺病毒載體在體外和體內(nèi)對卵巢癌治療作用的比較，證實攜帶人hEn