選擇性增殖腺病毒凈化造血干細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞混合物的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、高劑量化療(HDC)聯(lián)合自體造血干細(xì)胞移植(AHSCT)是治療惡性淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤等血液系統(tǒng)惡性腫瘤的重要手段，其對(duì)乳腺癌等某些實(shí)體瘤的治療研究尚在評(píng)價(jià)中。最新研究資料顯示對(duì)于高危難治性乳腺癌，HDC聯(lián)合AHSCT可顯著提高患者的無(wú)病生存率及總生存率。自體造血干細(xì)胞移植物中污染腫瘤細(xì)胞回輸常常是導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)的原因。因此移植物的體外凈化是業(yè)內(nèi)研究的方向之一。免疫磁性細(xì)胞分選(MACS)富集CD34+細(xì)胞凈化技術(shù)，是目前臨床最廣泛應(yīng)用的

2、造血干細(xì)胞移植物凈化方法。但綜合資料顯示該方法僅可獲得2-5個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)的腫瘤細(xì)胞去除，并未顯著延長(zhǎng)患者的生存期。因此，尋求新的自體造血干細(xì)胞移植物凈化方法自然成為提高療效的研究方向。 基因治療載體系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)造血干細(xì)胞與惡性腫瘤細(xì)胞表面腺病毒受體存在天然差異，這種差異為靶向凈化造血干細(xì)胞移植物提供了新的選擇?；蚬こ谈脑斓倪x擇性增殖腺病毒，可以特異性地殺傷腫瘤細(xì)胞，H101便是其中的代表。本課題組己完成的研究顯示，乳腺癌細(xì)胞、多

3、發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞表面腺病毒受體豐富，H101對(duì)其有較高轉(zhuǎn)染率；而造血干細(xì)胞卻基本不被腺病毒轉(zhuǎn)染。這啟發(fā)研究利用H101凈化自體造血干細(xì)胞移植物的可行性，并將其與目前最常用的MACS技術(shù)進(jìn)行比較，以尋求自體造血干細(xì)胞移植物體外凈化的最佳方案。 凈化效果評(píng)價(jià)體系的建立是比較上述兩種凈化方法的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。首先我們?cè)隗w外通過(guò)MTT比色法、集落形成法，研究了不同感染復(fù)數(shù)的H101對(duì)乳腺癌細(xì)胞、多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞以及造血干細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。結(jié)果

4、發(fā)現(xiàn)在一定感染復(fù)數(shù)范圍內(nèi)，H101對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷呈劑量效應(yīng)關(guān)系，200MOI可以完全殺滅腫瘤細(xì)胞；而該劑量對(duì)造血干細(xì)胞增殖能力基本沒(méi)有影響。繼之，建立了一套檢測(cè)自體造血干細(xì)胞移植物中的乳腺癌細(xì)胞及多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的方法。將腫瘤細(xì)胞系列倍比稀釋后與動(dòng)員后健康供者的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)混合。對(duì)乳腺癌細(xì)胞與PBMC的混合物，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)上皮細(xì)胞角蛋白CK-19mRNA表達(dá)，107個(gè)PBMC中混有10個(gè)乳腺癌細(xì)胞即可檢出；應(yīng)用

5、腫瘤細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)也可達(dá)到RT-PCR同樣的檢出效率。對(duì)于多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞與PBMC的混合物，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD45-CDl38+細(xì)胞，以及免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)λ型輕鏈表達(dá)，可以將102個(gè)腫瘤細(xì)胞從107個(gè)PBMC中檢測(cè)出來(lái)。 為了模擬臨床腫瘤患者自體造血干細(xì)胞移植物的凈化過(guò)程，在體外我們將腫瘤細(xì)胞與造血干細(xì)胞以1：100比例混合，分別以H101及MACS技術(shù)凈化，并用上述建立的腫瘤細(xì)胞檢測(cè)體系，評(píng)價(jià)兩種方案的凈化效率。結(jié)果

6、顯示對(duì)于乳腺癌細(xì)胞與造血干細(xì)胞的混合物，H101在200MOI感染復(fù)數(shù)、2小時(shí)的感染時(shí)間、1000[~1的感染體積下，應(yīng)用RT-PCR及集落形成法均未檢測(cè)到腫瘤細(xì)胞的存在；MACS技術(shù)也可達(dá)到相近的凈化效果。對(duì)于多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞與造血干細(xì)胞混合物的凈化顯示，H101及MACS技術(shù)也可達(dá)到相近的凈化效果。而以上兩種凈化方案對(duì)造血干細(xì)胞增殖能力均無(wú)明顯影響。 非肥胖糖尿病／嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷鼠(NOD／SCID鼠)是進(jìn)行造血干細(xì)胞凈化

7、評(píng)價(jià)的理想模型。在該品系小鼠體內(nèi)，對(duì)H101及MACS兩種凈化方法的凈化效率進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。在乳腺癌細(xì)胞清除效率方面，HE染色的肺、肝組織連續(xù)病理切片顯示，H101及MACS在合理的凈化條件下，均可顯著抑制NOD／SCID鼠肺內(nèi)成瘤；而未凈化組小鼠腫瘤細(xì)胞在肺內(nèi)形成多處癌巢。進(jìn)一步以RT-PCR檢測(cè)小鼠肺組織中人源性CKl9mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示，H101及MACS凈化組均未檢測(cè)到CKl9表達(dá)，而未凈化組可以檢測(cè)到特異性CKl9擴(kuò)增。

8、在造血重建方面，以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨髓中人源性免疫標(biāo)記的CD45+、CD45+CD34+、CD45+CDl9+、CD45+CD3+細(xì)胞，顯示在H101組、MACS組、未凈化組均獲得造血重建，并且人源性細(xì)胞的比例三組間沒(méi)有顯著差別。表明上述凈化手段對(duì)造血干細(xì)胞的造血重建能力沒(méi)有顯著影響。 本研究建立了理想的造血干細(xì)胞凈化效率評(píng)價(jià)體系；體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示H101與MACS技術(shù)對(duì)乳腺癌細(xì)胞及多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞與造血干細(xì)胞的混合物，可獲得同樣