雙調(diào)控減毒增殖腺病毒CNHK500治療肝癌的實驗研究.pdf

1、該文構(gòu)建出人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子和缺氧反應(yīng)啟動子雙調(diào)控的可攜帶抗癌基因減毒增殖型腺病毒CNHK500,通過體外實驗對CNHK500的選擇性殺傷腫瘤細胞的能力進行評估,并進一步觀察不同給藥途徑CNHK500對裸鼠移植瘤的治療效果,對其抗腫瘤機制進行初步探討.方法和結(jié)果:1、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子和缺氧反應(yīng)啟動子雙調(diào)控減毒增殖型腺病毒CNHK500的構(gòu)建和制備;2、雙調(diào)控增殖腺病毒CNHK500體外抗腫瘤療效觀察;CNHK500的E1A、E

2、1B蛋白表達檢測:通過Western blot檢測CNHK500的E1A、E1B蛋白的表達,發(fā)現(xiàn)重組病毒CNHK500的E1A蛋白表達存在細胞差異性,在腫瘤細胞(HT29、PANC-1、HepGⅡ、Hep3B)中可檢測到腺病毒早期蛋白E1A的表達,而在正常細胞中(MRC-5、IMR-90、BJ)中則難以檢測到E1A的表達,說明人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄啟動子可以有效調(diào)控E1A基因的表達.病毒增殖實驗:分別用重組腺病毒CNHK500感染不同來源的腫瘤

3、細胞株,觀察不同時相(0h、12h、24h、48h、96h)的病毒增殖情況,發(fā)現(xiàn)CNHK500在腫瘤細胞中能隨時間而大量復(fù)制增殖.熒光顯微鏡鏡檢觀察病毒增殖情況:將攜帶綠色熒光蛋白報告基因的腺病毒CNHK500-EGFP分別轉(zhuǎn)染正常細胞BJ及腫瘤細胞SMMC-7721、Hep3B、PANC-1,轉(zhuǎn)染后第3、7、10天在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達情況.細胞病理效應(yīng)(CPE).細胞活力實驗(MTT):按不同的MO1值將CNHK500

4、感染肝癌細胞株Hep3B、HepGⅡ及正常細胞株BJ、WRL-68細胞,計算出IC<,50>值.3.雙調(diào)控增殖腺病毒CNHK500治療裸鼠移植瘤的療效觀察;瘤內(nèi)注射CNHK500治療裸鼠SMMC-7721移植瘤:靜脈注射CNHK500治療裸鼠Hep3B移植瘤劑量-療效及生存期觀察:結(jié)論:本文成功構(gòu)建了由人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子調(diào)控E1A基因、人缺氧反應(yīng)啟動子調(diào)控E1B基因的減毒增殖型腺病毒CNHK500,體外實驗表明重組病毒CNHK500

5、可以選擇性地端粒酶陽性的腫瘤細胞中增殖、殺傷,而在正常細胞中基本不增殖,具有選擇性腫瘤細胞增殖能力,明顯優(yōu)于單用hTERT啟動子調(diào)控E1A基因的腺病毒CNHK300及E1B 55KD缺失的ONYX-015.用CNHK500分別治療小鼠SMMC-7721、Hep3B肝癌移植瘤模型觀察到明顯的抗腫瘤療效,治療組小鼠的腫瘤的生長速率明顯慢于對照組,且生存期顯著延長,具有明顯的量-效曲線.以上實驗結(jié)果表明CNHK500是一種有效且安全的溶瘤病毒