Tet-on系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)人突變A30Pα-synuclein小鼠的相關(guān)研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)方面展開(kāi)： 第一部分： Tet-on系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)人突變A30P α-synuclein轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建 目的：構(gòu)建Tet-on系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)人突變A30P α-synuclein轉(zhuǎn)基因小鼠。 方法：通過(guò)RT-PCR方法從人胎腦中克隆野生型SNCA基因,T-A克隆并測(cè)序，并利用單核苷酸差異引物定點(diǎn)誘變構(gòu)建致病突變Ala30Pro的SNCA基因，采用雙酶切法構(gòu)建含Ala30Pro致病突變基因的pTRE

2、2-syn載體，酶切鑒定，并測(cè)序。利用Tet-on系統(tǒng)，采用顯微注射法，同時(shí)將pTRE2-syn目的基因和pBC-rtTA調(diào)控基因注入FVB小鼠受精卵的雄原核中，注射受精卵移植到同期發(fā)情的假孕受體出生個(gè)體，取21日齡的斷乳小鼠剪尾法提取DNA，經(jīng)PCR檢測(cè)獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠，基因測(cè)序驗(yàn)證A30P的突變位點(diǎn)。 結(jié)果：電泳結(jié)果顯示RT-PCR方法成功克隆了SNCA基因的cDNA序列，目的基因?yàn)?81bp；含致病突變Ala30Pro的

3、SNCA基因的pTRE2-syn載體經(jīng)Bam HI和HindⅢ雙酶切鑒定正確，測(cè)序結(jié)果也顯示編碼α-突觸核蛋白第30位氨基酸的密碼子由GCA突變?yōu)镃CA,其相應(yīng)編碼的氨基酸由Ala突變?yōu)镻ro；經(jīng)PCR檢測(cè)檢測(cè)共得到rtTA和A30P突變型α-synuclein雙陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因F0代小鼠1只，A30P突變型α-synuclein單陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因F0代小鼠13只。 結(jié)論：成功構(gòu)建了受強(qiáng)力霉素調(diào)控的高表達(dá)A30P突變型α-synuclein

4、 Tet-On轉(zhuǎn)基因小鼠。 第二部分：人突變A30Pα-synuclein轉(zhuǎn)基因小鼠行為學(xué)特性的研究 目的：通過(guò)強(qiáng)力霉素(DOX)誘導(dǎo)，使人突變A30P α-synuclein基因大量表達(dá)，觀察突變基因表達(dá)后小鼠運(yùn)動(dòng)功能的行為學(xué)變化。 方法：雙陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因FVB小鼠，每組15只，并設(shè)雙陰性對(duì)照組15只，均于強(qiáng)力霉素1.5mg/ml飲水誘導(dǎo)。分別在誘導(dǎo)2周、誘導(dǎo)4周和誘導(dǎo)8周時(shí)對(duì)各組動(dòng)物的行為學(xué)指標(biāo)進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。小鼠

5、轉(zhuǎn)棒儀測(cè)定小鼠轉(zhuǎn)棒潛伏期；小鼠自發(fā)活動(dòng)箱測(cè)定小鼠自發(fā)活動(dòng)量；自制小鼠爬桿測(cè)定爬桿時(shí)間。 結(jié)果：誘導(dǎo)2周組與雙陰性對(duì)照之間的自發(fā)活動(dòng)、轉(zhuǎn)棒潛伏期及爬桿時(shí)間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；誘導(dǎo)滿4周后小鼠的自發(fā)活動(dòng)、轉(zhuǎn)棒潛伏期比陰性對(duì)照要明顯減少，爬桿時(shí)間明顯增加(p<0.01)；誘導(dǎo)滿8周的小鼠自發(fā)活動(dòng)最少，轉(zhuǎn)棒潛伏期最短，而相應(yīng)的爬桿時(shí)間最長(zhǎng)。 結(jié)論:強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠的運(yùn)動(dòng)功能存在顯著影響。誘導(dǎo)4周的時(shí)候較為明顯，并在4周后隨著

6、誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)癥狀越來(lái)越重。 第三部分：人突變A30P α-syunclein轉(zhuǎn)基因小鼠PD模型的建立與初步鑒定 目的：轉(zhuǎn)基因FVB小鼠誘導(dǎo)后出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能的變化，誘導(dǎo)4周后運(yùn)動(dòng)功能明顯衰退，為探討這一現(xiàn)象，進(jìn)一步觀察突變?chǔ)?synuclein表達(dá)情況以及相應(yīng)的解剖病理基礎(chǔ)。 方法：雙陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因FVB小鼠，每組15只，并設(shè)雙陰性對(duì)照組15只，均于強(qiáng)力霉素1.5mg／ml飲水誘導(dǎo)。分別以Western-blott

7、ing和RT-PCR法檢測(cè)誘導(dǎo)2周、4周和8周時(shí)α-synuclein蛋白表達(dá)及mRNA水平。小鼠黑質(zhì)連續(xù)切片，酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)免疫組織化學(xué)染色并觀察TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的變化。 結(jié)果:強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)后，α-synuclein在小鼠的小腦、腦干、海馬、皮層均有表達(dá)，海馬、皮層表達(dá)更多，誘導(dǎo)滿4周后，腦干α-synuclein表達(dá)明顯增加，8周后增加更明顯。轉(zhuǎn)基因小鼠α-synucleinRN