Tet-On誘導表達系統(tǒng)的構(gòu)建及TROP2生物學功能的研究.pdf

1、研究目的:
　　通過在293細胞中建立Tet-On誘導基因表達系統(tǒng)，檢測該系統(tǒng)是否能誘導TROP2蛋白的表達，并探討TROP2蛋白在促進細胞增殖、遷移與侵襲功能方面的作用。
　　研究方法:
　　1.Tet-On-Advanced穩(wěn)定細胞株的構(gòu)建
　　用Tet-On-Advanced質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細胞，通過G418篩選，RT-PCR法檢測四環(huán)素反應轉(zhuǎn)錄活化因子(rtTA)基因，篩選轉(zhuǎn)染陽性克隆。通過pTRE-Tig

2、ht-Luc載體轉(zhuǎn)染上述陽性轉(zhuǎn)染克隆，經(jīng)強力霉素(DOX)誘導熒光素酶表達，用螢火蟲熒光素酶試劑盒檢測，驗證Tet-On系統(tǒng)，篩出穩(wěn)定細胞株。
　　2.DOX調(diào)節(jié)293細胞中TROP2蛋白的表達
　　構(gòu)建含TROP2基因的重組載體pTRE-Tight-TROP2:采用PCR擴增TROP2基因，提取pTRE-Tight質(zhì)粒，EcoRⅠ與XbaⅠ雙酶切TROP2基因與pTRE-Tight質(zhì)粒，T4連接酶連接酶切產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化感受態(tài)D

3、H5α，挑單克隆菌株搖菌，將菌液做模板，擴增TROP2基因，取陽性株提取重組質(zhì)粒，送公司測序。
　　將pTRE-Tight-TROP2轉(zhuǎn)染進Tet-On-Advanced穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株，設立不同實驗組:Ⅰ組:不轉(zhuǎn)染pTRE-Tight-TROP2質(zhì)粒組;Ⅱ組:轉(zhuǎn)染pTRE-Tight-TROP2質(zhì)粒且加DOX(1000ng/ml)組;Ⅲ組:轉(zhuǎn)染pTRE-Tight-TROP2質(zhì)粒且不加DOX組。RT-PCR檢測不同組細胞的TROP2基

4、因，F(xiàn)CM檢測不同組細胞的TROP2蛋白表達。
　　3.TROP2蛋白對細胞增殖、遷移與侵襲功能的作用
　　通過增殖實驗、劃痕實驗、Transwell遷移實驗與Transwell侵襲實驗檢測TROP2蛋白功能。
　　研究結(jié)果:
　　1.Tet-On-Advanced穩(wěn)定細胞株的構(gòu)建
　　Tet-On-Advanced質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細胞，經(jīng)過G418篩選和亞克隆，獲得21株單克隆細胞株，擴大培養(yǎng)。RT-PCR

5、檢測21株單克隆細胞株中四環(huán)素反應轉(zhuǎn)錄活化因子(rtTA)基因，結(jié)果顯示，21株單克隆株中，有10株檢測到rtTA基因，編號為1-10。從10株細胞株中，用螢火蟲熒光素酶檢測試劑盒挑選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株，結(jié)果顯示，加DOX組的熒光素酶活性檢測結(jié)果明顯高于不加DOX組，從中選出熒光度值高于3000的4株細胞（1、2、6、9、號細胞株）為候選細胞?？紤]到本底的因素，1號細胞株被選出做為轉(zhuǎn)染效果最好的細胞株，用于后續(xù)試驗。
　　2.DOX調(diào)

6、節(jié)293細胞中TROP2蛋白的表達
　　PCR法擴增TROP2基因，結(jié)果顯示有大小為969bp的條帶，與預期結(jié)果相符。TROP2基因與pTRE-Tight載體經(jīng)雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細菌、涂板，挑10個單克隆菌落進行搖菌，將菌液做模板，擴增TROP2基因，得2株陽性菌株。提取質(zhì)粒，電泳顯示大小均為3574bp，與預期結(jié)果一致。核酸序列分析結(jié)果證明其序列正確，表明所得質(zhì)粒為重組質(zhì)粒pTRE-Tight-TROP2。

7、　　pTRE-Tight-TROP2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Tet-On-Advanced穩(wěn)定細胞株，經(jīng)DOX誘導，RT-PCR法檢測3組細胞中TROP2基因的表達水平，F(xiàn)CM法檢測3組細胞中TROP2蛋白的表達水平。結(jié)果顯示，加DOX組細胞中TROP2基因、蛋白的水平明顯高于對照組。
　　3.TROP2蛋白對細胞增殖、遷移與侵襲功能的作用
　　MTT法檢測細胞生長、增殖情況，結(jié)果顯示，加DOX組細胞增殖速度明顯比對照組細胞快;劃痕實驗

8、與Transwell遷移實驗用于檢測細胞遷移功能，拍照記錄、MTT檢測與結(jié)晶紫染色結(jié)果顯示，加DOX組細胞遷移能力明顯高于對照組;Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲功能，通過細胞計數(shù)及結(jié)晶紫染色，結(jié)果表明，相對于對照組，加DOX組細胞的侵襲功能明顯升高。
　　研究結(jié)論:
　　在293細胞中成功構(gòu)建了穩(wěn)定的Tet-On誘導表達系統(tǒng)，且誘導表達效果較為顯著。構(gòu)建重組質(zhì)粒pTRE-Tight-TROP2，將其轉(zhuǎn)染制各好的Tet