利用油體蛋白表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)人成骨蛋白的研究.pdf

1、人成骨蛋白-1(Human Osteogenic Protein1，hOP-1)，或稱骨形成發(fā)生蛋白7(Bone Morphogenetic Protein7，BMP7)，是TGF-β超家族中的一員，具有誘導(dǎo)IOPC(inducible osteogenic precursor cells)類細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化的蛋白質(zhì)，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。由于人骨源有限，直接從人骨中提取人成骨蛋白受到了限制，影響了臨床應(yīng)用。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)

2、展，異源表達(dá)成骨蛋白成為可能。
　　植物生物反應(yīng)器已廣泛應(yīng)用于外源高經(jīng)濟(jì)附加值的藥用蛋白、脂類及一些次生代謝產(chǎn)物等生物制劑的生產(chǎn)，其成本低，不僅能滿足人們生產(chǎn)和生活的需要，而且可以拓寬植物的應(yīng)用范圍。利用植物油體表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)人成骨蛋白有非常廣泛的前景。植物種子中油體蛋白(oleosin)是一類鑲嵌在油體表面的小分子堿性蛋白，在種子中高水平表達(dá)并大量積累，由于其脂溶性的特點(diǎn)，很容易將油體蛋白與種子中其他蛋白分開。而且當(dāng)外源小分子量蛋

3、白插入到油體蛋白的N端或C端后，不會(huì)影響到油體蛋白在植物油體上的定位及表達(dá)，而且外源蛋白本身也能高水平表達(dá)。在油料作物種子中利用油體蛋白做載體生產(chǎn)藥用蛋白及其它有用物質(zhì)，具有獨(dú)特的優(yōu)越性。
　　花生作為我國最重要的油料作物之一，既可以榨油和深加工，又可以生食，更為重要的是油體蛋白在花生種子中高水平表達(dá)并大量積累。所以，在花生種子中利用油體蛋白表達(dá)人成骨蛋白將具有廣闊的前景。本研究初步建立了花生油體蛋白表達(dá)體系表達(dá)人成骨蛋白的植物生

4、物反應(yīng)器體系，并且在轉(zhuǎn)基因煙草種子中進(jìn)行了表達(dá)，為在花生中轉(zhuǎn)化及利用該體系大規(guī)模生產(chǎn)人成骨蛋白和其它外源蛋白奠定了基礎(chǔ)。研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　人成骨蛋白-1基因密碼子的優(yōu)化:根據(jù)植物中密碼子表達(dá)的偏好性，將本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)克隆得到的人成骨蛋白-1基因的cDNA序列通過軟件分析進(jìn)行優(yōu)化后重新合成序列，為在植物中高效表達(dá)人成骨蛋白奠定了基礎(chǔ)。
　　人成骨蛋白-1的原核表達(dá):首先將人成骨蛋白-1基因的全長(zhǎng)cDNA序列(420 bp

5、)，連接到原核表達(dá)載體PET28a上，在大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示人成骨蛋白-1能夠正確表達(dá)，融合蛋白分子量約為15.7 KD，與預(yù)期大小基本一致。原核表達(dá)的蛋白可用于抗體制備及后期成骨蛋白檢測(cè)研究。
　　花生油體蛋白基因和啟動(dòng)子的克隆:根據(jù)NCBI中花生油體蛋白的基因序列，設(shè)計(jì)引物，克隆得到了花生油體蛋白的全長(zhǎng)基因及其啟動(dòng)子。
　　植物表達(dá)載體的構(gòu)建和優(yōu)化:將人成骨蛋白基因連接到花生油體蛋白基因的3’端，在油體蛋

6、白基因和成骨蛋白基因間插入腸肽酶基因序列，便于后期重組蛋白從油體蛋白上的分離。構(gòu)建由花生油體蛋白基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的“花生油體蛋白-腸肽酶-成骨蛋白”的融合植物表達(dá)載體。本研究還將pCAMBIA1301、pCAMBIA1302兩個(gè)載體進(jìn)行改造優(yōu)化，將兩個(gè)載體中的潮霉素(Hyg)抗性改為卡那(Kan)抗性，以降低研究及開發(fā)成本。
　　遺傳轉(zhuǎn)化和表達(dá)驗(yàn)證:利用葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草，通過RT-PCR的方法檢測(cè)了人成骨蛋白基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的表