利用昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)人KCTD9蛋白和人fgl2蛋白及人fgl2凝血酶原酶活性研究.pdf

1、背景及目的:
　　 根據(jù)世界衛(wèi)生組織截止到2005年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，全球乙型肝炎病毒感染者總數(shù)約20億，其中3.5億人為慢性乙肝患者，每年大約有60萬人死于乙型肝炎。0.1[％]～0.6[％]HBV急性感染者出現(xiàn)重癥肝炎，死亡率高達(dá)70[％]～90[％]。亞洲是乙肝病毒肆虐的重災(zāi)區(qū)，全球2/3以上的慢性乙肝患者生活在亞洲。而我國是HBV感染高發(fā)地區(qū)，僅HBV攜帶者就有1.3億，人群攜帶率約10[％]，所以我國重癥肝炎很常見。重癥肝炎

2、以急劇廣泛性肝細(xì)胞壞死為主要病理特征，臨床上可表現(xiàn)為嚴(yán)重的消化道癥狀、高度黃疸、肝性腦病、出血、肝腎綜合癥、繼發(fā)感染。該病病情嚴(yán)重，發(fā)展迅猛，發(fā)病機(jī)制尚不完全明了，臨床缺乏特異、有效的治療靶點(diǎn)和干預(yù)手段，死亡率高，而幸存者易發(fā)展成肝炎后肝硬化，生活質(zhì)量顯著下降。因此探索重癥肝炎發(fā)病機(jī)制、預(yù)防并阻止重癥肝炎的疾病演變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是我國急需解決的課題。
　　 本實(shí)驗(yàn)室利用基因芯片技術(shù)對(duì)重癥肝炎相關(guān)基因進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)慢性重癥肝炎患者外周

3、血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的基因表達(dá)譜與輕度慢性肝炎患者相比，差異性表達(dá)基因達(dá)300余個(gè)，其中2個(gè)與鉀離子通道相關(guān)的新基因，KCTD9(potassium channel tetramerisation domain containing 9)和KCNJ15(potassium inwardly-rectifying channel，subfamily J，member 15)，在慢性重癥肝炎患者中分別上調(diào)約6倍和7倍，并收集大量樣本經(jīng)實(shí)

4、時(shí)定量PCR證實(shí)結(jié)果可靠。33.3[％]HBV感染患者PBMC中KCTD9 mRNA高表達(dá)，以重癥肝炎組表達(dá)上調(diào)最顯著，且這部分患者PBMC中KCTD9 mRNA表達(dá)水平與其肝功能損害程度呈正相關(guān)。同時(shí)新近發(fā)現(xiàn)的纖維介素蛋白[Fibrinogen-like protein 2(fgl 2)/fibroleukin]屬纖維蛋白原相關(guān)蛋白超家族，又稱fgl2凝血酶原酶，具有絲氨酸蛋白酶活性可直接催化凝血酶原轉(zhuǎn)變成有活性的凝血酶，從而快速啟動(dòng)

5、凝血反應(yīng)。在鼠肝炎3型病毒(murine hepatitis virus-3，MHV-3)感染暴發(fā)型肝炎模型中，鼠fgl2凝血酶原酶(mfgl2)選擇性高度表達(dá)于病變肝組織，應(yīng)用中和抗體和mfgl2特異性的反義RNA可減輕肝臟疾病嚴(yán)重程度并顯著降低死亡率。同時(shí)在mfgl2基因敲除的暴發(fā)型肝炎小鼠模型中，生存率亦可從0[％]上升至40[％]。我們在重癥乙型肝炎病人的肝臟組織發(fā)現(xiàn)人fgl2凝血酶原酶高度表達(dá)。因此獲得持續(xù)來源的人KCTD9蛋

6、白和人fgl2蛋白對(duì)其功能進(jìn)行深入研究很有意義。故我們選擇BaculoDirect?這一最新型昆蟲－桿狀病毒蛋白表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)人KCTD9蛋白和人fgl2蛋白。
　　 方法:
　　 采用PCR法從擴(kuò)增出hKCTD9以及hfgl2基因片段，并分別連接至pENTR/D-TOPO載體，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)菌，提取連接后的質(zhì)粒并確認(rèn)序列正確。將入門克隆pENTR/D-TOPO-hKCTD9/hfgl2質(zhì)粒與線形桿狀病毒DNA連接后

7、即表達(dá)克隆(重組桿狀病毒DNA)，轉(zhuǎn)染易感細(xì)胞系昆蟲Sf9細(xì)胞，待重組桿狀病毒在細(xì)胞內(nèi)包裝好，收集并感染新一批Sf9細(xì)胞以擴(kuò)大培養(yǎng)。電子顯微鏡觀察感染后Sf9細(xì)胞中病毒顆粒的形成；激光免疫共聚焦技術(shù)檢測感染后昆蟲細(xì)胞表達(dá)hKCTD9蛋白的細(xì)胞定位；Western Blot分析融合蛋白hKCTD9以及hfgl2的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 PCR法證實(shí)重組入門克隆pENTR/D-TOPO-KCTD9/hfgl2和表達(dá)克隆(

8、桿狀病毒DNA)中hKCTD9/hfgl2融合基因構(gòu)建正確，入門克隆質(zhì)粒經(jīng)測序證實(shí)hKCTD9/hfgl2基因序列正確；透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)被感染的Sf9細(xì)胞核中存在大量的桿狀病毒，核漲大、透亮，核中可見病毒的衣殼、包膜以及桿狀病毒特有的核多角體蛋白；激光共聚焦顯微鏡證實(shí)感染重組桿狀病毒的Sf9細(xì)胞核內(nèi)可見綠色熒光，而未感染Sf9細(xì)胞中未見綠色熒光，提示前者有目的基因表達(dá)；Western Blot進(jìn)一步顯示hKCTD9蛋白大小約為55

9、KD，與基因庫中預(yù)測蛋白大小43KD不一致，與人PBMC中KCTD9蛋白大小一致。表達(dá)的hfgl2融合蛋白利用Western Blot檢測到跨模型和分泌型蛋白，大小分別為63KD和50KD，且跨模型hfgl2蛋白具有凝血功能。
　　 結(jié)論:
　　 ①利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功地表達(dá)了潛在重肝相關(guān)基因hKCTD9蛋白、hfgl2蛋白，為進(jìn)一步探討該基因在重癥乙型肝炎發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制提供了有力的工具。
　　

10、②hKCTD9單克隆抗體、多克隆抗體以及標(biāo)簽抗體均檢測到表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的hKCTD9蛋白的大小約55KD與基因庫中預(yù)測大小43KD相差12KD，考慮表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的KCTD9蛋白翻譯后存在加工修飾。由于桿狀病毒-昆蟲表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白更接近天然蛋白的生物學(xué)功能，因此該系統(tǒng)表達(dá)的hKCTD9蛋白的加工修飾也與體內(nèi)更為接近。故通過對(duì)表達(dá)蛋白結(jié)構(gòu)及修飾的研究為其生物學(xué)功能研究提供參考。
　　 ③hfgl2在昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)并