Fgl2在炎性腸病及腫瘤微環(huán)境中的作用與機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分進行論述：
　　第一部分 Fgl2在炎性腸病中的作用及機制研究
　　結(jié)腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，在全球惡性腫瘤中位居第三位，全世界每年有超過100萬的新增確診病例。已有相關(guān)研究表明，炎性腸病(Inflammatory boweldiseases，IBD)的炎癥程度及病程時間與癌變風(fēng)險呈正相關(guān)，流行病學(xué)研究顯示大約20％的IBD患者會在30年內(nèi)進展為腫瘤，并有50％以上死于腸癌。因此，深入闡明IB

2、D發(fā)生發(fā)展的分子機制，發(fā)展新型的IBD治療策略具有重要的科學(xué)意義。
　　IBD包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克隆恩氏病(CD)，是一組臨床上常見的以慢性腸道炎癥為特征的消化系統(tǒng)疾病。近幾十年來，IBD的發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)逐年升高，因此通過深入研究IBD的發(fā)病機理，開發(fā)新型的IBD免疫治療藥物是目前IBD治療領(lǐng)域的研究熱點。其中，以抗TNF-α單克隆抗體為代表的免疫治療手段在部分CD患者中能夠有效緩解臨床癥狀，但同時也發(fā)現(xiàn)相當(dāng)大比例的

3、UC和CD患者對抗TNF-α單克隆抗體的治療無效。因此，深入探索IBD發(fā)病過程中腸道粘膜免疫系統(tǒng)中的改變及相關(guān)分子機制，將為IBD的治療提供新思路和堅實的理論依據(jù)。
　　纖維介素蛋白2（Fibrinogen-like protein2，F(xiàn)gl2）屬于纖維介素相關(guān)蛋白超家族，是一種凝血酶原酶，催化凝血酶原Trombin向凝血酶Trombin的轉(zhuǎn)化，從而促進凝血級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生。同時，F(xiàn)gl2作為調(diào)節(jié)性T細胞（Treg細胞）的效應(yīng)分子，

4、通過抑制T細胞增殖，促進B細胞凋亡，抑制DC細胞的成熟發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)。新近研究發(fā)現(xiàn)，在IBD患者的血漿中，F(xiàn)gl2的表達升高;同時在活躍期的IBD患者的結(jié)腸潰瘍區(qū)檢測到Fgl2的高表達，但Fgl2在IBD發(fā)生發(fā)展中的具體作用及機制仍不明確。因此，我們通過構(gòu)建DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型，及AOM/DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎相關(guān)性腫瘤(CAC)模型，探討Fgl2在IBD和CAC中的作用，并進一步探討其可能的作用機制。
　　方法:

5、　　1.Fgl2在DSS誘導(dǎo)的小鼠IBD模型中的作用。
　　(1)在WT和Fgl2-KO小鼠中構(gòu)建DSS誘導(dǎo)的小鼠IBD模型;
　　(2)觀察DSS誘導(dǎo)期間WT和Fgl2-KO小鼠體重下降程度、腹瀉和便血等癥狀;
　　(3)測量DSS誘導(dǎo)周期結(jié)束后WT和Fgl2-KO小鼠結(jié)腸的長度;
　　2.Fgl2在AOM/DSS誘導(dǎo)的小鼠CAC模型中的作用。
　　(1)在WT和Fgl2小鼠中構(gòu)建AOM/DSS誘導(dǎo)的小鼠

6、CAC模型;
　　(2)觀察AOM/DSS誘導(dǎo)期間WT和Fgl2-KO小鼠體重的變化;
　　(3)AOM/DSS誘導(dǎo)周期結(jié)束后，比較WT和Fgl2-KO小鼠結(jié)腸中的腫瘤數(shù)量及腫瘤負荷。
　　3.Fgl2在小鼠IBD模型中的表達和定位。
　　(1)在C57BL/6小鼠中構(gòu)建DSS誘導(dǎo)的小鼠IBD模型;
　　(2)在DSS誘導(dǎo)的不同時間點（第0天、第2天、第4天、第7天）處死小鼠，并測量結(jié)腸的長度;
　　

7、(3)對DSS誘導(dǎo)不同時間點的小鼠結(jié)腸組織進行切片和HE染色，觀察上皮細胞屏障結(jié)構(gòu)、炎性細胞浸潤等的改變;
　　結(jié)果:
　　1.Fgl2在DSS誘導(dǎo)的小鼠IBD模型中發(fā)揮保護作用。
　　(1)相較于WT小鼠， Fgl2-KO小鼠在DSS誘導(dǎo)期間體重下降程度更大、腹瀉和便血等癥狀更嚴重;
　　(2)Fgl2-KO小鼠在DSS誘導(dǎo)周期結(jié)束后結(jié)腸長度縮短更明顯;
　　2.Fgl2抑制AOM/DSS誘導(dǎo)的炎性腸病相

8、關(guān)腫瘤的發(fā)生。
　　(1)Fgl2-KO小鼠在AOM/DSS誘導(dǎo)期間體重下降程度更大;
　　(2)Fgl2-KO小鼠在AOM/DSS誘導(dǎo)周期結(jié)束后，結(jié)腸組織中腫瘤數(shù)量更多、腫瘤負荷更大。
　　3.Fgl2在DSS誘導(dǎo)的IBD模型中的表達和定位。
　　(1)隨著DSS誘導(dǎo)時間的延長，IBD小鼠結(jié)腸長度逐漸縮短，上皮屏障結(jié)構(gòu)破壞更加顯著，炎性細胞浸潤增加;
　　(2)給予小鼠DSS誘導(dǎo)后，IBD小鼠結(jié)腸組織中膜

9、型Fgl2表達增加;
　　結(jié)論:
　　1.Fgl2在DSS誘導(dǎo)的小鼠IBD模型中發(fā)揮保護作用;
　　2.Fgl2抑制AOM/DSS誘導(dǎo)的炎性腸病相關(guān)腫瘤的發(fā)生;
　　3.Fgl2在DSS誘導(dǎo)的IBD模型中表達升高，腸道巨噬細胞、DC細胞和Treg細胞是Fgl2的主要來源;
　　4.造血細胞來源的Fgl2在DSS誘導(dǎo)的IBD模型中發(fā)揮保護作用;
　　5.Fgl2通過促進腸道巨噬細胞向M2型極化、抑制其向

10、M1型極化，在DSS誘導(dǎo)的IBD中發(fā)揮保護作用;
　　6.Fgl2直接調(diào)控巨噬細胞極化。
　　第二部分 間質(zhì)來源的Fgl2對腫瘤微環(huán)境的調(diào)控作用
　　腫瘤微環(huán)境是由腫瘤細胞、間質(zhì)細胞、細胞外基質(zhì)及由腫瘤細胞和間質(zhì)細胞分泌的細胞因子構(gòu)成的一個整體。大量研究表明，腫瘤微環(huán)境在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。
　　Fgl2屬于纖維介素相關(guān)蛋白超家族，是一種凝血酶原酶，在多種疾病中高表達于巨噬細胞和內(nèi)皮細胞表面。它通

11、過催化凝血酶原Trombin向凝血酶Trombin的轉(zhuǎn)化，促進凝血級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生。此外，F(xiàn)gl2作為調(diào)節(jié)性T細胞（Treg細胞）的效應(yīng)分子，通過抑制T細胞增殖，促進B細胞凋亡，抑制DC細胞的成熟等發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)。
　　既往研究表明，F(xiàn)gl2在多種實體瘤中表達升高，如肝癌、腎癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、胃癌和卵巢癌等，并通過影響腫瘤細胞生物學(xué)功能促進腫瘤發(fā)生發(fā)展。新近在小鼠膠質(zhì)瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤細胞分泌的Fgl2可以上調(diào)腫瘤微環(huán)境中P

12、D-1和CD39等免疫抑制分子的表達，并促進腫瘤微環(huán)境中免疫抑制性的細胞募集，從而促進腫瘤進展。但是，我們通過使用Cancer Cell Line Encyclopedia(CCLE)數(shù)據(jù)庫，對各類腫瘤細胞系中Fgl2的mRNA水平進行分析發(fā)現(xiàn)上皮細胞來源的腫瘤細胞系中Fgl2均為低表達，結(jié)合文獻和我們此前在IBD中的研究，F(xiàn)gl2在多種疾病中主要由免疫細胞表達，提示腫瘤間質(zhì)細胞來源的Fgl2可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。因此我們

13、通過在Fgl2-KO小鼠中構(gòu)建小鼠Lewis肺癌(Lewis lung carcinoma，LLC)皮下移植瘤模型，探討間質(zhì)細胞來源的Fgl2對肺癌腫瘤微環(huán)境的調(diào)控以及在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　方法:
　　1.間質(zhì)細胞來源的Fgl2在小鼠LLC皮下成瘤模型中的作用。
　　(1)在WT和Fgl2-KO小鼠中構(gòu)建LLC皮下荷瘤模型;
　　(2)接種腫瘤細胞后，每3天對腫瘤大小進行測量，并繪制腫瘤生長曲線;

14、　　2.Fgl2對LLC腫瘤微環(huán)境的影響。
　　(1)在WT和Fgl2-KO小鼠中構(gòu)建LLC皮下荷瘤模型;
　　(2)荷瘤15天后，麻醉并處死小鼠，獲取腫瘤組織，制備腫瘤組織單細胞懸液，流式細胞學(xué)分析腫瘤組織中CD45+細胞、TAM(F4/80+CD206+)、DC(CD11c+MHCII+)、MDSC（CD11b+Gr-1+）、Treg(CD4+Foxp3+)和CD8+T（CD3+CD8a+）細胞的比例;
　　(3)

15、 qRT-PCR檢測WT和Fgl2-KO小鼠腫瘤組織中NOS2、Arg1、VEGF和TGF-β的表達;
　　3.Fgl2對CAF細胞活化和功能的調(diào)控。
　　(1)在WT和Fgl2-KO小鼠中構(gòu)建LLC皮下荷瘤模型;
　　(2)荷瘤15天后，麻醉并處死小鼠，獲取腫瘤組織，制備腫瘤組織單細胞懸液，流式細胞學(xué)分析腫瘤組織中CAF細胞的比例;
　　結(jié)果:
　　1.間質(zhì)細胞來源的Fgl2促進LLC腫瘤的生長。

16、　　(1)與WT小鼠相比，F(xiàn)gl2-KO小鼠腫瘤生長明顯減緩;
　　(2)荷瘤21天后，F(xiàn)gl2-KO小鼠腫瘤重量明顯小于WT小鼠腫瘤重量;
　　(3)在LLC皮下移植瘤模型中，F(xiàn)gl2來源于腫瘤間質(zhì)細胞。
　　2.Fgl2促進LLC腫瘤微環(huán)境中MDSC的募集。
　　(1)荷瘤15天后，當(dāng)兩組小鼠腫瘤大小沒有明顯差異時，流式細胞學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)Fgl2-KO小鼠腫瘤組織中MDSC比例相較于WT小鼠明顯降低;