γδT細(xì)胞在人大腸癌炎性微環(huán)境中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　大腸癌是最常見的致死性惡性腫瘤之一。早在19世紀(jì)Rudolf Virchow便提出炎癥與腫瘤之間存在密切聯(lián)系。越來越多的證據(jù)表明，腫瘤相關(guān)炎癥能夠通過促進(jìn)血管新生和轉(zhuǎn)移、顛覆抗腫瘤免疫應(yīng)答及改變腫瘤細(xì)胞對化療藥的敏感性等方面促進(jìn)腫瘤的生長和進(jìn)展。持續(xù)性的炎性微環(huán)境也能通過觸發(fā)基因突變從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。持續(xù)存在的炎癥細(xì)胞及因子亦能將腫瘤相關(guān)炎性微環(huán)境轉(zhuǎn)化為免疫抑制微環(huán)境從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。
　　炎癥因子IL-23

2、/IL-17調(diào)控軸在人大腸癌發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。有研究顯示，Th17細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)特征與大腸癌患者無瘤生存率呈負(fù)相關(guān)。雖然小鼠結(jié)腸癌模型研究提示，Th17細(xì)胞是大腸癌IL-17的主要來源。但是，人大腸癌IL-17的主要來源問題尚未被直接證明。此外，IL-17及其相關(guān)因子促進(jìn)人大腸癌發(fā)生和進(jìn)展的確切機(jī)制尚不清楚。
　　γδT細(xì)胞是一類分布于外周血及粘膜組織的非MHC限制性固有T淋巴細(xì)胞。最近，γδT細(xì)胞被證明是炎癥性腸病、銀屑

3、病、皮炎及肝炎中主要的IL-17分泌細(xì)胞并在疾病發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。小鼠模型研究顯示，γδT細(xì)胞能夠通過分泌IL-17促進(jìn)腫瘤血管新生。然而，γδT細(xì)胞在人類腫瘤相關(guān)炎性微環(huán)境中的特征及作用尚無研究報(bào)道。我們試圖研究γδT細(xì)胞在大腸癌相關(guān)炎癥及免疫微環(huán)境中的作用及機(jī)制。
　　研究方法：
　　為了明確炎性γδT細(xì)胞在人大腸癌中的鑒定及特征，我們首先通過RT-PCR及ELISA方法檢測了人大腸癌及配對正常組織內(nèi)IL-17A等

4、炎癥細(xì)胞因子的基因及蛋白質(zhì)表達(dá)水平。然后通過原代細(xì)胞分離及流式檢測分析IL-17A分泌細(xì)胞亞群鑒定。通過組織及細(xì)胞培養(yǎng)上清ELISA檢測大腸癌組織及其浸潤γδT細(xì)胞的IL-17A分泌量。最后通過免疫熒光驗(yàn)證γδTCR及IL-17A在腫瘤組織的共定位。
　　為了闡明γδT17細(xì)胞在大腸癌炎性微環(huán)境中的極化及機(jī)制。我們首先通過RT-PCR及ELISA對大腸癌配對組織內(nèi)IL-23基因及蛋白質(zhì)表達(dá)水平進(jìn)行檢測。然后通過激光共聚焦顯微鏡檢測

5、了IL-23與DC細(xì)胞標(biāo)志CD11c及IL-23與巨噬細(xì)胞標(biāo)志CD68在腫瘤組織的共定位。我們通過流式檢測分析了腫瘤及配對正常組織中總DC細(xì)胞(CD45+ HLA-DR+ CD11c+)、CD14+ DC細(xì)胞、炎癥性DC細(xì)胞(inflammatory dendritic cells(infDCs), CD45+ Lin-HLA-DR+ CD11c+ CD1c+CD16-)及炎癥性巨噬細(xì)胞(inflammatory macrophages

6、(infMs)，CD45+ Lin-HLA-DR+ CD11c+ CD1c-CD16+)的表達(dá)情況。同時(shí)，我們通過吉姆薩染色及流式分析對流式分選出來的腫瘤浸潤infDCs的形態(tài)學(xué)及表型特征進(jìn)行了鑒定。然后，我們通過RT-PCR及ELISA對大腸癌配對組織浸潤infDCs及infMs的IL-23基因及蛋白質(zhì)表達(dá)水平進(jìn)行檢測。為了進(jìn)一步解釋IL-23在腫瘤組織表達(dá)增高的原因，我們將流式分選出來的正常腸粘膜浸潤infDCs和infMs在體外條

7、件培養(yǎng)基（熱滅活的E.coli.、Pam3、LPS、CD40L、E.coli.DNA或單純培養(yǎng)基）中孵育3天并通過ELISA檢測其上清中IL-23分泌量。為了進(jìn)一步研究infDCs對γδT17細(xì)胞在腫瘤內(nèi)的極化作用，我們首先將正常腸粘膜分選出來的幼稚γδT細(xì)胞與條件培養(yǎng)基（培養(yǎng)基+熱滅活的E.coli.、正常組織來源上清、腫瘤組織來源上清、培養(yǎng)基+IL-23、腫瘤組織來源上清+IL-23中和抗體或腫瘤組織來源上清+同型抗體）孵育14天并

8、通過流式檢測γδT17細(xì)胞在總γδT細(xì)胞中的比例。最后，我們將從正常組織分選出來的infDCs通過體外條件培養(yǎng)基（培養(yǎng)基+熱滅活的E.coli.）預(yù)激活3天，然后我們將不同預(yù)處理后的infDCs（未預(yù)激活的infDCs及預(yù)激活的infDCs）與正常粘膜分選出來的幼稚γδT細(xì)胞于條件培養(yǎng)基（培養(yǎng)基含/或不合IL-23中和抗體或IL-23同型抗體）中共培養(yǎng)14天，最后我們通過多色流式分析檢測γδT17細(xì)胞在總γδT細(xì)胞中的比例。
　　

9、為了研究腫瘤浸潤IL-23分泌型infDCs增高的潛在機(jī)制，我們首先通過免疫熒光染色檢測瘤內(nèi)、癌旁及相對正常組織內(nèi)緊密連接蛋白（ZO-1及claudin-2）表達(dá)情況。為了進(jìn)一步闡明腫瘤上皮完整性缺失與瘤內(nèi)細(xì)菌侵入的關(guān)系，我們通過RT-PCR(Real time PCR)、ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)及FISH(Fluorescence in situ hybridization)的方

10、法檢測腫瘤及配對正常組織內(nèi)細(xì)菌16sRNA及細(xì)菌產(chǎn)物L(fēng)PS（Lipopolysaccharide）的含量。
　　為了進(jìn)一步研究腫瘤內(nèi)γδT17細(xì)胞增高對腫瘤炎性微環(huán)境的影響及機(jī)制，我們首先通過ELISA檢測了預(yù)激活infDCs對腫瘤浸潤γδT17細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響。同時(shí)我們通過多色流式分析及ELISA檢測腫瘤及配對正常組織浸潤γδT17細(xì)胞的IL-8、GM-CSF及TNF-α分泌情況。然后，我們通過多色流式分析檢測潛在受到腫瘤

11、浸潤γδT17細(xì)胞影響的MDSCs(Myeloid-derived suppressor cells)亞群在腫瘤及配對正常組織的比例（數(shù)量），并通過吉姆薩染色、ELISA、DCFDA(2'，7'-Dichlorofluorescein diacetate)染色及共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)鑒定流式分選出來的腫瘤浸潤主要MDSCs亞群的形態(tài)學(xué)特征、arginaseⅠ分泌、ROS(Reactive oxygen species)含量及T細(xì)胞抑制功能。通過多色

12、流式分析，我們比較了腫瘤、配對正常組織及同源周血與及健康人的外周血內(nèi)PMN-MDSCs(Polymorphonuclear myeloid-derivedsuppressor cells)的數(shù)量。最后，我們將腫瘤浸潤γδT17細(xì)胞或細(xì)菌裂解產(chǎn)物預(yù)激活infDCs誘導(dǎo)的γδT17細(xì)胞與流式分選出來的PMN-MDSCs共培養(yǎng)，并通過細(xì)胞計(jì)數(shù)及流式分析檢測γδT17細(xì)胞對PMN-MDSCs趨化、增殖及存活的影響。
　　為了研究腫瘤浸潤γ

13、δT17細(xì)胞與大腸癌臨床病理特征、腫瘤浸潤免疫細(xì)胞及炎癥細(xì)胞因子的相關(guān)性，首先我們分析了腫瘤浸潤γδT17細(xì)胞百分率及絕對數(shù)量與腫瘤分期（型）的相關(guān)性。然后我們分析了腫瘤浸潤γδT17細(xì)胞百分率與腫瘤大小、淋巴結(jié)浸潤、血管浸潤、腫瘤局部浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化及血液CEA（Carcino embryonie antigen）濃度的相關(guān)性。最后我們分析了腫瘤浸潤γδT17細(xì)胞百分率與infDCs百分率、PMN-MDSCs百分率、IL-2

14、3濃度及IL-17A濃度的相關(guān)性。
　　研究結(jié)果：
　　1.炎性γδT細(xì)胞在人大腸癌中的鑒定及特征。
　　IL-17A的基因及蛋白質(zhì)表達(dá)水平在人大腸癌組織均明顯增高。腫瘤內(nèi)分泌IL-17A的細(xì)胞主要為CD3+T淋巴細(xì)胞。無論是IL-17A分泌型CD45+細(xì)胞還是CD3+T細(xì)胞均明顯增高。腫瘤內(nèi)CD8+T(Tc17)細(xì)胞、CD4+T(Th17)細(xì)胞及γδTCR+T細(xì)胞均能分泌IL-17A。 Tc17、Th17及γδT17

15、細(xì)胞的百分率及絕對數(shù)量在大腸癌中均顯著增高。然而，γδT17細(xì)胞在大腸癌中的數(shù)量顯著高于Tc17及Th17細(xì)胞。通過免疫熒光染色在腫瘤內(nèi)能夠清楚的看到腫瘤浸潤γδT17細(xì)胞。腫瘤浸潤γδT細(xì)胞分泌IL-17A的量明顯高于配對正常腸粘膜浸潤γδT細(xì)胞，而IFN-γ分泌量未見明顯差異。
　　80％-90％的腫瘤及配對正常腸粘膜浸潤γδT細(xì)胞表達(dá)CD69，而少于50％的同源外周血γδT細(xì)胞表達(dá)CD69。少量腫瘤浸潤γδT17細(xì)胞同時(shí)分泌

16、IL-17A和IL-17F。大多數(shù)腫瘤浸潤γδT17細(xì)胞同時(shí)分泌IL-17A和TNF-α，但不分泌IFN-γ。腫瘤浸潤γδT17細(xì)胞分泌TNF-α的量明顯高于配對正常組織。相反，腫瘤浸潤Th17細(xì)胞僅分泌少量的TNF-α。腫瘤及配對正常腸粘膜浸潤γδT17細(xì)胞均未見明顯的IL-22、IL-10及IL-4分泌。表型方面，67.4％-83.6％的腫瘤浸潤γδT17細(xì)胞為Vδ1+細(xì)胞，僅少于10％的腫瘤浸潤γδT17細(xì)胞為Vδ2+細(xì)胞。腫瘤浸

17、潤γδT17細(xì)胞高表達(dá)CD45RO、CD161及CCR6，但不表達(dá)granzyme B、perforin、FasL、 TRAIL、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD25和CD122。有趣的是，大多數(shù)正常組織中γδT17細(xì)胞為中央記憶T細(xì)胞（TCM，CD45RA-CD27+），而腫瘤浸潤γδT17細(xì)胞大多為效應(yīng)記憶T細(xì)胞(TEM，CD45RA-CD27-)。分布上，腫瘤浸潤γδT17細(xì)胞數(shù)量在腫瘤邊緣（大約12％-24％

18、）及瘤內(nèi)（大約8％-13％）均明顯高于配對正常組織（大約1％-6％）。
　　2.γδT17細(xì)胞在大腸癌炎性微環(huán)境中的極化及機(jī)制。
　　IL-23p19轉(zhuǎn)錄水平及IL-23蛋白水平在腫瘤組織內(nèi)明顯增高。免疫熒光染色顯示，IL-23p19在腫瘤組織與CD11c+DC細(xì)胞共定位，但我們未見其與CD68+巨噬細(xì)胞在腫瘤內(nèi)的明顯共定位。為了明確IL-23在腫瘤內(nèi)的細(xì)胞來源，我們檢測了腫瘤浸潤總DC細(xì)胞(CD45+ Lin-HLA-DR

19、+ CD11c+)及不同DC細(xì)胞亞群的IL-23表達(dá)情況。我們發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤總DC細(xì)胞和CD14+ DC(CD45+ Lin-HLA-DR+CD11c+ CD14+)細(xì)胞的百分率及數(shù)量均明顯高于配對正常組織及同源外周血。進(jìn)一步的研究顯示，infDCs和infMs在腫瘤內(nèi)均明顯增高。形態(tài)學(xué)分析顯示腫瘤浸潤infDCs具有明顯的樹突狀結(jié)構(gòu)和DC細(xì)胞形態(tài)，而infMs為典型的巨噬細(xì)胞形態(tài)。表型上，腫瘤浸潤infDCs高表達(dá)CD80、CD83、C

20、D86、PD1、CD206、HLA-DR及CD11c，提示這些細(xì)胞為具有負(fù)向免疫調(diào)節(jié)潛能的未成熟DC細(xì)胞。進(jìn)一步研究顯示，腫瘤浸潤infDCs的百分率及絕對數(shù)量均明顯高于配對正常組織、同源外周血及正常人外周血。腫瘤浸潤炎癥性巨噬細(xì)胞也明顯高于配對正常組織，但炎癥性巨噬細(xì)胞的百分率及數(shù)量在腫瘤與同源外周血及正常人外周血之間并無明顯差異。腫瘤浸潤infDCs表達(dá)的IL-23在轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平均明顯高于配對正常組織浸潤infDCs。熱滅火的

21、E.coli.、Pam3、LPS和CD40L體外能激活infDCs并促進(jìn)其IL-23分泌。與配對正常組織相比，腫瘤組織來源的上清通過IL-23誘導(dǎo)正常腸粘膜來源的γδT細(xì)胞分泌IL-17。更重要的是，細(xì)菌產(chǎn)物預(yù)激活的infDCs能夠通過分泌IL-23有效誘導(dǎo)γδT17細(xì)胞的極化。
　　為了明確導(dǎo)致大腸癌組織浸潤infDCs激活的細(xì)菌產(chǎn)物的來源問題，我們檢測了腫瘤組織上皮完整性。通過ZO-1、claudin-2和pan-cytoke

22、ratin免疫熒光共染我們發(fā)現(xiàn)，緊密連接蛋白ZO-1和claudin-2在腫瘤內(nèi)表達(dá)減少并排布紊亂，提示腫瘤內(nèi)上皮完整性缺失。對新鮮組織內(nèi)LPS含量檢測發(fā)現(xiàn)，腫瘤勻漿來源上清內(nèi)LPS含量明顯高于配對正常組織。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤內(nèi)細(xì)菌16sRNA含量明顯高于配對正常組織，且細(xì)菌侵入主要集中于腫瘤邊緣。
　　3.γδT17細(xì)胞促進(jìn)大腸癌免疫抑制及腫瘤進(jìn)展。
　　在細(xì)菌產(chǎn)物預(yù)激活infDCs與γδT細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，我們發(fā)現(xiàn)體

23、外預(yù)激活infDCs能夠誘導(dǎo)γδT細(xì)胞分泌IL-8、TNF-α、 GM-CSF及IL-17。γδT細(xì)胞的IL-17A、IL-8和GM-CSF分泌部分依賴于infDCs來源的IL-23，而TNF-α分泌不依賴于IL-23。胞內(nèi)細(xì)胞因子流式檢測顯示，50％以上的腫瘤浸潤γδT17細(xì)胞同時(shí)分泌IL-8、TNF-α及GM-CSF。 IL-8+γδT17細(xì)胞、TNF-α+γδT17細(xì)胞和GM-CSF+γδT17細(xì)胞在腫瘤內(nèi)明顯增高。相反，腫瘤浸潤

24、Th17的IL-8、TNF-α及GM-CSF分泌量未見明顯增高。通過對CD161+ CCR6+γδT17細(xì)胞培養(yǎng)上清ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤C(jī)D161+ CCR6+γδT17細(xì)胞IL-8、TNF-α及GM-CSF分泌量明顯高于配對正常組織浸潤C(jī)D161+ CCR6+γδT17細(xì)胞。
　　同時(shí)，通過對大腸癌浸潤MDSCs檢測分析我們發(fā)現(xiàn)，一群以CD45+ Lin-HLA-DR-CD11b+ CD33+ CD66b+為特征的PMN

25、-MDSCs在腫瘤內(nèi)明顯高于配對正常組織。通過MDSCs特征鑒定，我們發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞具有分泌arginase-Ⅰ、 ROS和抑制T細(xì)胞增殖及分泌Ⅰ FN-γ等特性。形態(tài)學(xué)分析顯示，該細(xì)胞為典型的多核細(xì)胞。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，PMN-MDSCs的百分率及絕對數(shù)量在大腸癌內(nèi)均顯著高于配對正常組織、同源外周血及健康人外周血。更重要的是，大腸癌內(nèi)PMN-MDSCs的數(shù)量是M-MDSCs的80多倍。為了研究大腸癌組織浸潤γδT17細(xì)胞對PMN-MDSC

26、s及腫瘤免疫微環(huán)境的潛在影響。我們通過體外共培養(yǎng)體系研究發(fā)現(xiàn)，體外誘導(dǎo)γδT17細(xì)胞及腫瘤浸潤γδT17細(xì)胞均能夠通過IL-8及GM-CSF促進(jìn)PMN-MDSCs趨化。γδT17細(xì)胞分泌的IL-17A及GM-CSF能夠在24小時(shí)內(nèi)顯著促進(jìn)PMN-MDSCs增殖。更重要的是，體外γδT17細(xì)胞能夠通過分泌IL-8、 IL-17A及TNF-α促進(jìn)PMN-MDSCs的存活。
　　通過對大腸癌浸潤γδT17細(xì)胞數(shù)量與病人臨床分期的相關(guān)分析

27、，我們發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤γδT17細(xì)胞百分率及絕對數(shù)量與TNM分期呈正相關(guān)。大腸癌浸潤γδT17細(xì)胞百分率與其他臨床病理特征-腫瘤大小、淋巴管及血管浸潤、腫瘤局部浸潤、腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及血清CEA水平呈正相關(guān)。通過對另一組病人數(shù)據(jù)的分析，我們發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤γδT17細(xì)胞數(shù)量與infDCs、PMN-MDSCs、IL-23和IL-17A呈正相關(guān)。另外，腫瘤內(nèi)IL-23與infDCs及IL-17表達(dá)量呈正相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　我們的

28、研究首次明確證明了固有γδT細(xì)胞是人大腸癌內(nèi)IL-17的主要來源。機(jī)制上，腫瘤上皮完整性的缺失導(dǎo)致共生菌及其產(chǎn)物侵入腫瘤，從而激活infDCs并促進(jìn)其IL-23分泌。infDCs分泌的IL-23誘導(dǎo)γδT17細(xì)胞的腫瘤內(nèi)極化并促進(jìn)其分泌IL-8、GM-CSF、TNF-α及IL-17A等炎癥因子分泌。最終，腫瘤浸潤γδT17細(xì)胞通過這些炎癥因子促進(jìn)PMN-MDSCs在腫瘤的趨化、增殖及存活從而為腫瘤細(xì)胞營造一個(gè)免疫抑制微環(huán)境。我們同時(shí)也發(fā)