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文檔簡介
1、目的:鑒于纖維介素蛋白(fgl2)與嚴(yán)重急性呼吸綜合征(severeacuterespiratorysyndrome,SARS)患者血栓形成有密切聯(lián)系,本課題旨探索SARS冠狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白與人纖維介素基因(hfgl2)的相互作用機制,為防治SARS提供新的靶點。 方法:從SARS尸檢病毒滅活肺組織中抽提RNA后制備cDNA,分別擴增SARS-CoY的N、M和S2全長基因序列,再分別克隆到真核表達載體pcDNA3.1上。構(gòu)建了SA
2、RS冠狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-N、pcDNA3.1-M和pcDNA3.1-S2。分別與hfgl2啟動子熒光素酶報告基因質(zhì)粒及β半乳糖苷酶基因質(zhì)粒(β-Gal)共轉(zhuǎn)染到CHO細胞,采用免疫組織化學(xué)鑒定病毒蛋白的表達。通過檢測報告基因熒光素酶(LUC)及β半乳糖苷酶的表達活性,反映病毒蛋白對hfgl2啟動子的轉(zhuǎn)錄激活作用。將一系列hfgl2啟動子區(qū)5'端缺失而保留共同3'端的啟動子蟲熒光素酶報告基因質(zhì)粒,與SARS冠狀病
3、毒蛋白真核表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CHO細胞,并檢測各組細胞的相對熒光素酶活性,明確在病毒蛋白刺激下該基因5'端非編碼區(qū)對轉(zhuǎn)錄激活起重要作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。 結(jié)果: 1.通過酶切和核苷酸測序表明:目的片段成功克隆至pcDNA3.1,構(gòu)建了SARS冠狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-N、pcDNA3.1-M和pcDNA3.1-S2。免疫組織化學(xué)染色可見明顯的CHO細胞胞漿棕染,說明N基因、M基因和S2基因的真核表達質(zhì)粒構(gòu)建
4、成功,能夠在蛋白水平表達。 2.通過與hfgl2啟動子共轉(zhuǎn)染實驗表明:SARS冠狀病毒膜(M)蛋白和刺突糖(S2)蛋白對hfgl2基因的激活與對照組無顯著差異,而SARS冠狀病毒核心(N)蛋白可激活hfgl2啟動子,使其轉(zhuǎn)染活性提高6倍。 3.通過與一系列hfgl2啟動子區(qū)段共轉(zhuǎn)染實驗表明: 轉(zhuǎn)染前三個質(zhì)粒hfgl2p(-1334)LUC、hfgl2p(-997)LUC、hfgl2p(-816)LUC的細胞熒光素
5、酶活性改變無顯著差異,但轉(zhuǎn)染hfgl2p(-468)LUC質(zhì)粒的細胞熒光素酶的活性較前顯著降低,說明在hfgl2基因啟動子-816位至-468位(相對于翻譯起始點)之間存在著SARS冠狀病毒N蛋白激活該基因的調(diào)控序列。 結(jié)論: 本研究成功構(gòu)建SARS冠狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白真核表達質(zhì)粒,揭示了SARS冠狀病毒N蛋白具有增強hfgl2基因轉(zhuǎn)錄活性的功能,明確了在SARS冠狀病毒核心(N)蛋白作用下與該基因表達有關(guān)的調(diào)控序列,初步探
6、討了SARS-CoV與宿主基因間的相互作用,為進一步研究SARS冠狀病毒的細胞信號傳導(dǎo)途徑奠定了基礎(chǔ)。 本研究的意義 近來研究表明SARS患者的肺組織中有血栓形成[5]。根據(jù)血栓形成區(qū)fgl2基因的高表達現(xiàn)象,我們推測hfgl2基因參與SARS的炎性病變。本研究分別構(gòu)建了SARS冠狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白N、M和S2的真核表達質(zhì)粒和hfgl2啟動子熒光素酶報告基因質(zhì)粒(hfgl2p-LUC)。將兩者共轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢(CHO)細胞
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