人fg12凝血酶原酶基因的克隆、表達(dá)及其生物學(xué)功能的初步研究.pdf

1、為了今后對fg12凝血酶原酶作更深入的研究,該實(shí)驗(yàn)擬應(yīng)用分子生物學(xué)方法,克隆及表達(dá)fg12凝血酶原酶基因,并對其功能作初步的探討.第一部分中國漢族人fg12凝血酶原酶基因的克隆和序列分析;目的:克隆中國漢族人fg12凝血酶原酶cDNA,了解其序列與歐美人種(白人)有無差異,為今后的研究奠定基礎(chǔ).結(jié)論:成功地克隆了中國人fg12凝血酶原酶cDNA,其序列與國外報(bào)道一致;構(gòu)建了pcDNA3-fg12真核表達(dá)載體.第二部分人fg12凝血酶原酶

2、基因的真核表達(dá)及其功能的初步研究;目的:將人fg12凝血酶原酶基因的真核表達(dá)載體pcDNA3-fg12,轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞,使其在該細(xì)胞株中瞬時(shí)表達(dá),研究其凝血有關(guān)的生物學(xué)活性.結(jié)論:成功地在HL-60細(xì)胞中將fg12凝血酶原酶進(jìn)行了瞬時(shí)表達(dá);fgl2凝血酶原酶在胞漿中表達(dá),在細(xì)胞膜上無分布并可能排泌到細(xì)胞外;凝血分析顯示fg12凝血酶原酶具有直接激活凝血酶原的活性.第三部分fg12凝血酶原酶基因FRED段在大腸桿菌中的表達(dá);目的:建立

3、fg12凝血酶原酶纖維蛋白原相關(guān)結(jié)構(gòu)域(FRED段)的原核高效表達(dá)系統(tǒng),為制備抗fg12抗體及進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能創(chuàng)造條件.結(jié)論:成功地獲得了fg12凝血酶原酶的FRED段的基因表達(dá)產(chǎn)物,構(gòu)建了FRED- pET22b原核表達(dá)質(zhì)粒,并在大腸桿菌中獲得了高效表達(dá). 第四部分外周血單個(gè)核細(xì)胞中fg12凝血酶原酶基因表達(dá)的初步研究;(1)RT-PCR檢測外周血單個(gè)核細(xì)胞中fg12凝血酶原酶mRNA的表達(dá);目的:建立半定量檢測外周血單個(gè)核細(xì)胞

4、中mRNA表達(dá)水平的RT-PCR方法,探討fg12凝血酶原酶在正常人PBMNC中的表達(dá)及其規(guī)律.結(jié)論:建立了半定量檢測外周血單個(gè)核細(xì)胞中mRNA表達(dá)水平的RT-PCR方法,PBMNC中的fg12凝血酶原酶在體外培養(yǎng)體系中不能持續(xù)表達(dá).(2)重型肝炎患者fg12凝血酶原酶基因的表達(dá). 目的:探討重型肝炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMNC)中fg12凝血酶原酶mRNA的變化及其意義.結(jié)論:重型肝炎患者的肝壞死可能與fg12凝血酶原酶的高表達(dá)有