蛋白表達(dá)技術(shù)

1、蛋白表達(dá)技術(shù),蛋白表達(dá)技術(shù),,,蛋白表達(dá)涵義,,蛋白表達(dá)系統(tǒng)組成,,原核表達(dá),,真核表達(dá),無(wú)細(xì)胞表達(dá),蛋白表達(dá)的涵義,,蛋白表達(dá)是指用模式生物如細(xì)菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞或者植物細(xì)胞表達(dá)外源基因蛋白的一種分子生物學(xué)技術(shù),在基因工程技術(shù)中占有核心地位。,一、原核表達(dá)系統(tǒng),大腸桿菌是基因工程研究中采用最多的原核表達(dá)體系。1977 年，Itakura 等成功地在 E. coli 中表達(dá)了一種哺乳動(dòng)物的肽類激素 － 生長(zhǎng)激素抑制素，從而首次實(shí)現(xiàn)了外

2、源基因在原核細(xì)胞中的體外表達(dá)。這被認(rèn)為是基因工程發(fā)展史上的一座里程碑。優(yōu)越性：①對(duì)大腸桿菌的基礎(chǔ)生物學(xué)、分子遺傳學(xué)等背景知識(shí)和基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)理已有了深刻了解；②商品化的載體和菌株種類非常齊全；③表達(dá)效率高；④易培養(yǎng)，成本低。,缺點(diǎn)：①因分泌能力不足，真核蛋白質(zhì)常形成不溶性的包含體；②蛋白質(zhì)不能糖基化；③其內(nèi)毒素很難除去。,Factors in E.coli protein expression,一個(gè)蛋白要成功的在E.c

3、oli系統(tǒng)表達(dá)，就是要根據(jù)表達(dá)目的在載體，菌株和培養(yǎng)條件三個(gè)主要因素之間找到一個(gè)理想的結(jié)合點(diǎn)。,表達(dá)載體,,表達(dá)系統(tǒng)中最重要的元件是表達(dá)載體，表達(dá)載體應(yīng)當(dāng)具有表達(dá)量高、穩(wěn)定性好、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。表達(dá)載體主要包括啟動(dòng)子、表達(dá)閱讀框、終止子、復(fù)制起 點(diǎn) 以 及 抗 性 篩 選 標(biāo) 記 等 重 要元件,,近年來(lái)的研究表明，在科研和工業(yè)上被廣泛應(yīng)用的大腸桿菌表達(dá)載體主要有 pGE 系列、pQE 系和 pET 系列，其中目前被廣泛應(yīng)用的高效表達(dá)

4、載體是 pET。,復(fù)制起始點(diǎn)：保證載體可以正確復(fù)制和增殖，決定質(zhì)粒載體在宿主中的拷貝數(shù)?？寺≥d體常采用拷貝數(shù)低、嚴(yán)謹(jǐn)復(fù)制的復(fù)制子通常表達(dá)載體都會(huì)選用高拷貝的復(fù)制子 選擇性基因-篩選標(biāo)記：藍(lán)白斑篩選（主要用于克隆）、營(yíng)養(yǎng)缺陷性篩選、抗生素篩選（青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性、四環(huán)素抗性等）。,復(fù)制起始點(diǎn)：保證載體可以正確復(fù)制和增殖，決定質(zhì)粒載體在宿主中的拷貝數(shù)?？寺≥d體常采用拷貝數(shù)低、嚴(yán)謹(jǐn)復(fù)制的復(fù)制子通常表達(dá)載體都會(huì)選用

5、高拷貝的復(fù)制子 選擇性基因-篩選標(biāo)記：藍(lán)白斑篩選（主要用于克?。?、營(yíng)養(yǎng)缺陷性篩選、抗生素篩選（青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性、四環(huán)素抗性等）。多克隆位點(diǎn)：DNA載體序列上人工合成的一段序列，含有多個(gè)限制內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。能為外源DNA提供多種可插入的位置或插入方案。,,啟動(dòng)子：能被RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列轉(zhuǎn)錄形式：組成型、誘導(dǎo)型強(qiáng)弱：取決于-35區(qū)和-10區(qū)的堿基組成及其間隔序列?！磉_(dá)載體通

6、常選用強(qiáng)啟動(dòng)子以提高表達(dá)量，但弱啟動(dòng)子也有其優(yōu)點(diǎn)，如降低本底表達(dá)、增加可溶表達(dá)、表達(dá)小量伴侶蛋白等。,T7啟動(dòng)子----最常用啟動(dòng)子基于 T7 RNA 聚合酶及其強(qiáng)啟動(dòng)子之間的特異性和轉(zhuǎn)錄的高效性建立的 pET 系統(tǒng)( No-vagen) 是最常用的 E. coli 表達(dá)系統(tǒng)。T7 NAP 機(jī)制在誘導(dǎo)蛋白表達(dá)時(shí)，幾乎所有的細(xì)胞資源都用于表達(dá)目的蛋白，而且表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)量也特別高。,終止子：終止點(diǎn)前含有一段7-20bp的回文序列，可以保護(hù)m

7、RNA在核外不被降解，顯著延長(zhǎng)mRNA的壽命，由此提高重組蛋白的表達(dá)量。融合標(biāo)簽：利用DNA體外重組技術(shù)，與目的蛋白一起融合表達(dá)的一種多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表達(dá)、檢測(cè)、示蹤和純化等。標(biāo)簽位置的選擇：----N端融合：易于構(gòu)建。終止密碼子來(lái)自載體基因，表達(dá)量高提前終止會(huì)干擾純化二級(jí)翻譯起始，不影響純化---- C端融合：構(gòu)建時(shí)注意避免移碼，基因不能自帶終止密碼子，提前終止不影響純化，二級(jí)翻譯起始會(huì)干擾純化常用融合標(biāo)簽

8、His·TagpET系統(tǒng) GST·TagpGEX系統(tǒng) MBP·TagpMal系統(tǒng),,TrxHISHis6是指六個(gè)組氨酸殘基組成的融合標(biāo)簽，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。組氨酸殘基側(cè)鏈與固態(tài)的鎳有強(qiáng)烈的吸引力，可用于固定化金屬螯合層析(IMAC)，對(duì)重組蛋白進(jìn)行分離純化。 優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)簽的分子量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分別為~26KD和~30KD，一般不影響目標(biāo)蛋白的功能；

9、His標(biāo)簽融合蛋白可以在非離子型表面活性劑存在的條件下（純化疏水性強(qiáng)的蛋白）或變性條件（純化包涵體蛋白）下純化，用高濃度的變性劑溶解后通過(guò)金屬螯和親和層析去除雜蛋白，使復(fù)性不受其它蛋白的干擾，或進(jìn)行金屬螯和親和層析復(fù)性；His標(biāo)簽融合蛋白也被用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA相互作用研究；His標(biāo)簽免疫原性相對(duì)較低，可將純化的蛋白直接注射動(dòng)物進(jìn)行免疫并制備抗體。可應(yīng)用于多種表達(dá)系統(tǒng)，純化的條件溫和；可以和其它的親和標(biāo)簽一起構(gòu)建雙

10、親和標(biāo)簽。,Flag標(biāo)簽蛋白Flag標(biāo)簽蛋白為編碼8個(gè)氨基酸的親水性多肽（DYKDDDDK），同時(shí)載體中構(gòu)建的Kozak序列使得帶有FLAG的融合蛋白在真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)效率更高。 優(yōu)點(diǎn)：FLAG作為融合表達(dá)標(biāo)簽，其通常不會(huì)與目的蛋白相互作用并且通常不會(huì)影響目的蛋白的功能、性質(zhì)，這樣就有利用研究人員對(duì)融合蛋白進(jìn)行下游研究。融合FLAG的目的蛋白，可以直接通過(guò)FLAG進(jìn)行親和層析，此層析為非變性純化，可以純化有活性的融合蛋白，并

11、且純化效率高。FLAG作為標(biāo)簽蛋白，其可以被抗FLAG的抗體識(shí)別，這樣就方便通過(guò)Western Blot、ELISA等方法對(duì)含有FLAG的融合蛋白進(jìn)行檢測(cè)、鑒定。融合在N端的FLAG，其可以被腸激酶切除（DDDK），從而得到特異的目的蛋白。因此現(xiàn)FLAG標(biāo)簽已廣泛的應(yīng)用于蛋白表達(dá)、純化、鑒定、功能研究及其蛋白相互作用等相關(guān)領(lǐng)域。,MBP（麥芽糖結(jié)合蛋白）MBP（麥芽糖結(jié)合蛋白）標(biāo)簽蛋白大小為40kDa，由大腸桿菌K12的malE

12、基因編碼。優(yōu)點(diǎn)：MBP可增加在細(xì)菌中過(guò)量表達(dá)的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。MBP標(biāo)簽可通過(guò)免疫分析很方便地檢測(cè)。有必要用位點(diǎn)專一的蛋白酶切割標(biāo)簽如果蛋白在細(xì)菌中表達(dá)，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。 純化：融合蛋白可通過(guò)交聯(lián)淀粉親和層析一步純化。結(jié)合的融合蛋白可用10mM麥芽糖在生理緩沖液中進(jìn)行洗脫。結(jié)合親和力在微摩爾范圍?？捎肕BP抗體或表達(dá)的目的蛋白特異性抗體檢測(cè)。,GST(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶)GST(谷胱甘肽

13、巰基轉(zhuǎn)移酶) 標(biāo)簽蛋白本身是一個(gè)在解毒過(guò)程中起到重要作用的轉(zhuǎn)移酶，它的天然大小為26KD?？芍苯訌募?xì)菌裂解液中利用含有還原型谷胱甘肽瓊脂糖凝膠親和樹(shù)脂進(jìn)行純化。優(yōu)點(diǎn)：作為高度可溶的蛋白，可增加外源蛋白的可溶性；在大多數(shù)情況下GST融合蛋白是完全或部分可溶的?？稍诖竽c桿菌中大量表達(dá)，起到提高表達(dá)量的作用。標(biāo)簽有助于保護(hù)重組蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其穩(wěn)定性。GST標(biāo)簽蛋白可在溫和、非變性條件下洗脫，因此保留了蛋白的抗原性和生

14、物活性。GST在變性條件下會(huì)失去對(duì)谷胱甘肽樹(shù)脂的結(jié)合能力，因此不能在純化緩沖液中加入強(qiáng)變性劑如：鹽酸胍或尿素等。如果要去除GST融合部分，可用位點(diǎn)特異性蛋白酶切除。檢測(cè)：可用GST抗體或表達(dá)的目的蛋白特異性抗體檢測(cè)。,常用表達(dá)載體系統(tǒng),,,目的蛋白表達(dá)形式及在細(xì)胞中的定位,,蛋白表達(dá)形式,,分泌蛋白:采用信號(hào)肽序列可以將蛋白直接分泌到細(xì)菌的周質(zhì)腔去。,,,可溶性蛋白:目的蛋白與一段融合標(biāo)簽序列 （FLAG、His － Tag、GFP

15、 等) 融合表達(dá)而形成,包涵體蛋白 :包涵體蛋白的形成是由于肽鏈折疊過(guò)程中，部分折疊中間態(tài)發(fā)生特異性錯(cuò)誤聚合，不能形成成熟的天然或完全解鏈的蛋白所致,,宿主菌的選擇,用于克隆的宿主菌 K12系列NovaBlue，JM109以及DH5 a。特點(diǎn)：recA–endA–型，轉(zhuǎn)化效率很高，且質(zhì)粒產(chǎn)量高，適合用于保存帶有克隆目的基因的pET載體。用于表達(dá)的宿主菌所有 B 型菌株，B834，BL21，BLR，Origami B，Rosett

16、a及Tuner特點(diǎn)：都缺乏純化過(guò)程中降解蛋白的lon蛋白酶及 ompT 外膜蛋白酶。目的蛋白在這些菌株中的穩(wěn)定性要高于帶有這些蛋白酶的菌株，BL21(DE3)是用得最多的表達(dá)菌,E.coli宿主菌,,,表達(dá)條件優(yōu)化,,,增加可溶性和折疊,選擇大腸桿菌偏愛(ài)密碼子,毒性基因及質(zhì)粒穩(wěn)定性,合適載體與宿主菌組合,表達(dá)條件優(yōu)化,毒基因：基因表達(dá)產(chǎn)物——即目的蛋白，影響宿主生長(zhǎng)（“毒性”）,例1:載體對(duì)表達(dá)的影響,pET32,BL21(DE3),

17、表達(dá)的蛋白:Trx-His6-EK-IFN(MW35KD),pET43,BL21(DE3),表達(dá)的蛋白:Nus-His6-S Tag-EK-IFN(MW78KD),誘導(dǎo)后,破菌上清,破菌沉淀,誘導(dǎo)前,誘導(dǎo)前,誘導(dǎo)后,破菌沉淀,破菌上清,破菌上清,例2:宿主菌對(duì)表達(dá)的影響,Tissue plasminogen activator (tPA,9 disulfide bonds) was expressed in three differen

18、t hosts. 10 mg of soluble protein was spotted onto fibrin agarose plates and incubated for 24 h at 37°C. Zone of clearing measures biological activity of tPA.,pET32,例3:表達(dá)條件對(duì)表達(dá)的影響,pET21,BL21(DE3)-RIL,表達(dá)的蛋白:His6-REIIB

19、P(MW67KD),U:Uninduced crude extractI:Crude extract after inducedS:Lysis supertanantP:Lysis precipitation,大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的研究新進(jìn)展近幾年來(lái)，對(duì)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的研究，已經(jīng)從最初的構(gòu)建不同的表達(dá)載體建立新的表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移為完善現(xiàn)有的表達(dá)系統(tǒng)，解決表達(dá)系統(tǒng)中的各種缺陷，包括: 采用 RosettaTM( No-vagen) 代

20、替 BL21 菌株來(lái)增強(qiáng)含有 E. coli 稀有密碼子的重組蛋白的表達(dá)水平; 采用 BL21( DE3) 、BL21 ( DE3) pLysS 以及BL21( DE3) pLysE ( Invitrogen) 彌補(bǔ)高濃度的胞內(nèi)酶環(huán)境對(duì)具有生物活性的目的蛋白在 E. coli 中表達(dá)的抑制等。,最近幾年來(lái)，研究人員逐步將研究重點(diǎn)放在通過(guò)將一些具有活性的小蛋白與目的蛋白融合，進(jìn)而促進(jìn)目的蛋白在 E. coli中的表達(dá)，或者通過(guò)改造某種現(xiàn)有

21、的表達(dá)載體，通過(guò)將各種促溶標(biāo)簽與載體融合，進(jìn)而使得某些在 E. coli 中不表達(dá)的蛋白得以表達(dá)或使原本以包涵體形式表達(dá)的蛋白以可溶性形式表達(dá)。這些標(biāo)簽包括 FLAG、MBP、GST、thioredoxin 等。,其他原核表達(dá)式系統(tǒng),乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng) 乳酸菌是革蘭氏陽(yáng)性菌，膜單一，在大量膜蛋白的表達(dá)方而提供了革蘭氏陰性菌無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)，原因是革蘭氏陰性菌具有內(nèi)外膜并覆蓋著厚厚的、剛性的肚聚糖層的內(nèi)表而周質(zhì)空間影響蛋白質(zhì)的表達(dá)，而

22、蛋白在乳酸乳球菌中的表達(dá)是通過(guò)融合Mistic到目標(biāo)膜蛋白而加以改善，提高其表達(dá)量。,芽袍桿菌表達(dá)系統(tǒng) 芽抱桿菌(Bacillus)也屬于革蘭氏陽(yáng)性菌。橋石短芽抱桿菌和枯草芽抱桿菌表達(dá)系統(tǒng)由Takara, MoBiTec公司開(kāi)發(fā)與提供。芽抱桿菌能過(guò)表達(dá)并且能分泌外源蛋白到培養(yǎng)基中，這適合分泌型蛋白的生產(chǎn)，如細(xì)胞因子或需要形成復(fù)雜二硫鍵的外源蛋白。,,真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),為了克服原核表達(dá)系統(tǒng)的不足，許多學(xué)者將原核基因調(diào)控系統(tǒng)引入到真核

23、基因調(diào)控領(lǐng)域?；蚬こ坛Ｓ玫恼婧吮磉_(dá)系統(tǒng)有: 酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞,酵母表達(dá)系統(tǒng),酵母是一種低等的單細(xì)胞真核生物，它既具有原核生物易于培養(yǎng)、繁殖快、便于基因工程操作等特點(diǎn)，同時(shí)又具有真核生物蛋白質(zhì)加工、折疊、翻譯后飾等的功能。目前工業(yè)生產(chǎn)中最重要的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)是酵母表達(dá)系統(tǒng)。優(yōu)越性：①蛋白可糖基化，有相對(duì)正確的天然結(jié)構(gòu)，可很好的生產(chǎn)分泌型蛋白；②表達(dá)載體為整合型質(zhì)粒，載體中含有與酵母染色體中同源的序列，因而比較容

24、易整合入酵母染色體中，實(shí)現(xiàn)高效率表達(dá)；③表達(dá)載體都為E.coli/Pichia Pastoris的穿梭載體，可在獲得克隆后采用E.coli細(xì)胞大量擴(kuò)增。④易培養(yǎng)，成本低,可高密度發(fā)酵。,缺點(diǎn)：①糖基化與哺乳動(dòng)物有所差別；②培養(yǎng)上清多糖濃度高，不利于純化。,酵母表達(dá)系統(tǒng)發(fā)展,第 39 頁(yè),釀酒酵母,甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母,粟酒裂殖酵母,,,長(zhǎng)久以來(lái)被稱為真核生物中的“大腸桿菌”，最早應(yīng)用于酵母基因的克隆和表達(dá)。目前利用釀酒酵母為宿主細(xì)胞

25、表達(dá)了多種外源基因，如乙型肝炎疫苗、人胰島素、人粒細(xì)胞集落刺激因子、人血管抑制素等。,1983 年，美國(guó) Wegner 等人最先發(fā)展了以甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母 為代表的第二代酵母表達(dá)系統(tǒng)。甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母包括: 畢赤酵母、漢森酵母、假絲酵母。以 畢赤巴斯德酵母為宿主的外源基因表達(dá)系統(tǒng)近年來(lái)發(fā)展最為迅速，應(yīng)用也最為廣泛。,酵母細(xì)胞中生理特性最接近高等生物的一種，其染色體結(jié)構(gòu)和功能，細(xì)胞循環(huán)的控制，RNA 剪接蛋白表達(dá)分泌機(jī)制及翻譯后修飾等都與哺乳動(dòng)

26、物細(xì)胞很相似。近年來(lái)，有學(xué)者提出它可能也是潛在的能有效表達(dá)真核膜蛋白的表達(dá)系統(tǒng).,甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的酵母表達(dá)系統(tǒng)，以Pichia Pastoris應(yīng)用最多。,畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)模式載體,甲醇氧化酶啟動(dòng)子A、目前已發(fā)現(xiàn)的、最強(qiáng)的真核啟動(dòng)子B、嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控型啟動(dòng)子 AOX1：葡萄糖和甘油脫阻遏、甲醇誘導(dǎo) MOX：葡萄糖阻遏、甘油脫阻遏、甲醇誘導(dǎo),,甲醇酵母的表達(dá)載體為整合型質(zhì)粒，載體中含有與酵母染色體中

27、同源的序列，因而比較容易整合入酵母染色體中。甲醇酵母一般先在含甘油的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，培養(yǎng)至高濃度。再以甲醇為碳源。誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白。這樣可以大大提高表達(dá)產(chǎn)量。利用甲醇酵母表達(dá)外源性蛋白質(zhì)其產(chǎn)量往往可達(dá)克級(jí)。與釀酒酵母相比其翻譯后的加工更接近哺乳動(dòng)物細(xì)胞，不會(huì)發(fā)生超糖基化。,近年來(lái)，用該表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)的蛋白達(dá)到了300多種，表達(dá)的蛋白主要包括基因工程疫苗，如乙肝疫苗及一些來(lái)自動(dòng)植物和細(xì)菌的各種酶、膜受體蛋白、抗原和抗體及一些用來(lái)研究晶

28、體結(jié)構(gòu)的蛋白等。同時(shí)，該系統(tǒng)作為一種基礎(chǔ)研究的模型系統(tǒng)在分子生物學(xué)領(lǐng)域也發(fā)揮了越來(lái)越重要的作用，如用該系統(tǒng)進(jìn)行過(guò)氧化物酶體的輸入和組裝及真核細(xì)胞的分泌途徑和功能等方面的研究。目前國(guó)內(nèi)也有多種蛋白在該系統(tǒng)中獲得了高效表達(dá)，如人白蛋白、人胰島素、干擾素、乙肝表面抗原、集落刺激因子等幾十種蛋白質(zhì)。,昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是目前國(guó)內(nèi)外很推崇的真核表達(dá)系統(tǒng)。依托桿狀病毒結(jié)構(gòu)基因中多角體蛋白的強(qiáng)啟動(dòng)子而構(gòu)建的表達(dá)載體，有效甚至高水平地使很多真核目的基因得

29、到表達(dá)。利用重組桿狀病毒在昆蟲(chóng)細(xì)胞體系中表達(dá)外源蛋白是目前較為流行的表達(dá)方式。優(yōu)越性：①重組蛋白具有完整的生物學(xué)功能，如蛋白的正確折疊、二硫鍵的搭配；②可容納較大片段的外源DNA插入，因此是表達(dá)大片段DNA的理想載體；③可進(jìn)行分泌表達(dá)。,缺點(diǎn)：①糖基化與哺乳動(dòng)物有所差別；②表達(dá)量有限；③作為藥物宿主細(xì)胞未被FDA認(rèn)可； ④培養(yǎng)成本高。,2.昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng),桿狀病毒基因組：閉環(huán)雙鏈DNA，88-166kb表達(dá)系

30、統(tǒng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（BEVS）家蠶核型多角體病毒-家蠶表達(dá)系統(tǒng)宿主：鱗翅目、膜翅目、雙翅目、鞘翅目、直翅目、脈翅目、毛翅目的600多種昆蟲(chóng)克隆基因方法：轉(zhuǎn)移載體→共轉(zhuǎn)染→同源重組→空斑篩選→純化→重組病毒,桿狀病毒載體的構(gòu)建發(fā)展,3. 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)表達(dá)系統(tǒng),當(dāng)前，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)已成為生物藥物生產(chǎn)的重要技術(shù)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞常用于表達(dá)高活性的人源重組蛋白。優(yōu)越性：①糖基化與人源蛋白一致；②能表達(dá)天然結(jié)構(gòu)的完整蛋白，活性

31、很高；③可進(jìn)行分泌表達(dá)。,缺點(diǎn)：①表達(dá)量低；②培養(yǎng)成本很高，操作繁瑣。,常用宿主細(xì)胞,表達(dá)栽體,哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)外源重組蛋白可利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和病毒載體的感染。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體必須包含原核序列、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、選擇標(biāo)記基因、終止子和多聚核苷酸信號(hào)等控制元件根據(jù)進(jìn)入宿主細(xì)胞的方式，可將表達(dá)載體分為病毒載體與質(zhì)粒載體。,病毒載體:是以病毒顆粒的方式，通過(guò)病毒包膜蛋白與宿主細(xì)胞膜的相互作用使外源基因進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)。常用的病毒載體有S

32、V40病毒、腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、痘苗病毒桿狀病毒載體應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)在近幾年頗受重視，這是因?yàn)樗c其它病毒載體相比有特有優(yōu)勢(shì)，如可通過(guò)昆蟲(chóng)細(xì)胞大量制備病毒顆粒；可感染多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞，但在細(xì)胞內(nèi)無(wú)復(fù)制能力，生物安全度高；可插入高達(dá)38 kb的外源基因等。,質(zhì)粒載體則是借助于物理或化學(xué)的作用導(dǎo)人細(xì)胞內(nèi)。依據(jù)質(zhì)粒在宿主細(xì)胞內(nèi)是否具有自我復(fù)制能力，可將質(zhì)粒載體分為整合型和附加體型載體兩類。整合型載體無(wú)復(fù)制能力，需整合于宿主細(xì)胞染色

33、體內(nèi)方能穩(wěn)定存在，如SV40病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體和游離型如痘苗病毒、腺病毒載體。利用 Sindbis virus(SV)、Scmliki Forest virus(sFV) 和痘苗病毒載體感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的蛋白在結(jié)構(gòu)與功能上與天然哺乳動(dòng)物來(lái)源的蛋白更相似。Liljestrom等利用SFV病毒載體感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞獲得的外源蛋白占細(xì)胞總蛋白的；,附加體型載體則是在細(xì)胞內(nèi)以染色體外可自我復(fù)制的附加體形式存在。整合型載體一般是隨機(jī)整合入

34、染色體，其外源基因的表達(dá)受插入位點(diǎn) 的影響，同時(shí)還可能會(huì)改變宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)特性。相比之下，附加體型載體不存在這方面的 問(wèn)題，但載體DNA在復(fù)制中容易發(fā)生突變或重排。,猴多瘤病毒DNA（SV40）,SV40屬于乳多瘤病毒科多瘤病毒屬，呈小型二十面體，由VP1、VP2、VP3三種衣殼蛋白包裝而成，基因組為5224bp的雙鏈環(huán)狀DNASV40可以與所有哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中的組蛋白H2、H3、H4結(jié)合，從而使其DNA形成類似核小體的微型染色體結(jié)構(gòu)

35、。 SV40感染猴細(xì)胞時(shí)呈裂解型，不致癌；但感染嚙齒類動(dòng)物后，便發(fā)生非同源整合而致癌。 SV40在裂解宿主細(xì)胞前的晚期狀態(tài)時(shí)，每個(gè)宿主細(xì)胞含有105個(gè)病毒DNA拷貝，因此十分適合用于高效表達(dá)外源蛋白,SV40的生物學(xué)特性,SV40 DNA-質(zhì)粒DNA雜合載體的構(gòu)建,重組的SV40 DNA分子必須經(jīng)過(guò),包裝后才具有感染能力，因此插入的,外源DNA片段不能太大。為了盡量提,高SV40的裝載量，必須刪除一些基因,

36、片段，因此重組的SV40分子必須與野,生型病毒共感染受體細(xì)胞，才能形成,有感染力的重組病毒顆粒。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Apr,ori,viral gene,gpt,SV40 ori,pV2-GPT,,,,,pBR322,pBR322,,,SV40,pV2-GPT是一種SV40 DNA與大腸桿菌質(zhì)粒DNA雜合的載體，其,中g(shù)pt為細(xì)菌來(lái)源的谷氨酸-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因，用于篩選重組子。該,載體曾被成功地用于在猴腎細(xì)胞中表

37、達(dá)有生物活性的兔b-珠蛋白.,人乳多瘤病毒DNA（BKV）,人乳多瘤病毒（BKV）屬于乳多瘤病毒科乳頭瘤病毒屬，其基因組為雙鏈DNA，感染宿主細(xì)胞后基因不發(fā)生整合，獨(dú)立于染色體而自主復(fù)制，每個(gè)宿主細(xì)胞最高可達(dá)500個(gè)拷貝,人乳多瘤病毒的生物學(xué)特性,人乳多瘤病毒表達(dá)載體的構(gòu)建,BKV - E.coli 穿梭載體,BKV ori,BKV gene,DRE,MMTP,Ap r,E.coli ori,SV40 P,Neo r,刪除編碼病毒核

38、心蛋白和外殼蛋白的,基因，并與大腸桿菌質(zhì)粒拼接，構(gòu)成,穿梭載體，它不能整合，同時(shí)也不能,形成成熟的病毒顆粒裂解受體細(xì)胞。,安裝細(xì)胞色素P450 dioxin介導(dǎo)的增強(qiáng),子DRE，控制小鼠乳腺癌啟動(dòng)子MMTP，由其帶動(dòng)外源基因的表達(dá)。,SV40來(lái)源的啟動(dòng)子控制Neor 標(biāo)記基因，以G418篩選重組子。,以此載體在人細(xì)胞系中表達(dá)b1-干擾素和單純皰疹病毒B蛋白獲得成功。,利用SV40 DNA載體表達(dá)外源基因的程序,SV40 載體,病毒晚期基

39、因啟動(dòng)子,,篩選標(biāo)記,ori,缺陷的SV40 輔助病毒,,去除細(xì)菌序列,插入外源基因,重組分子,,分離病毒DNA,,,,,轉(zhuǎn)化,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,篩選,增殖,感染,通過(guò)強(qiáng)化基因轉(zhuǎn)錄高效表達(dá)外源基因,在載體上安裝病毒或細(xì)胞來(lái)源的強(qiáng)啟,,,,,,mRNA前體,,,,AAAAAAAAA,mRNA,動(dòng)子以及有效的翻譯元件，是使外源基,因高效表達(dá)的一種手段，如：,細(xì)胞巨化病毒CMV的啟動(dòng)子,動(dòng)

40、物珠蛋白基因的內(nèi)含子,SV40的終止子和polyA化信號(hào)序列,絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)型載體,上攜帶內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，因?yàn)閙RNA前體的剪,切能促進(jìn)成熟mRNA向胞質(zhì)的運(yùn)輸，有利,于翻譯。有的還含有各種信號(hào)肽序列。,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)蛋白的方式有兩種：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的特點(diǎn)是短期快速表達(dá)，滿足蛋白的小量制備。細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)能夠快速靈活的制備重組蛋白，細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后1-4天內(nèi)即可收獲并進(jìn)行分析。,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染通過(guò)穩(wěn)

41、定細(xì)胞系能夠滿足蛋白的大量、長(zhǎng)期生產(chǎn)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的是將外源基因整合到細(xì)胞自身基因組上，隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)分裂外源基因可以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)，同時(shí)經(jīng)過(guò)抗生素加壓篩選，最終得到能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)蛋白的細(xì)胞株。,發(fā)展歷史,1987年FDA批準(zhǔn)了基因泰克公司生產(chǎn)的組織型纖溶酶原激活劑（tPA）, 世界上第一個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞制備的重組蛋白質(zhì)藥物標(biāo)志著哺乳動(dòng)物細(xì)胞制備重組蛋門時(shí)代的到來(lái)。經(jīng)過(guò)20多年的發(fā)展，哺乳動(dòng)物細(xì)胞制備重組蛋白技術(shù)發(fā)生了巨大的變化。主要表現(xiàn)在

42、: (1) 細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，由過(guò)去的7天延長(zhǎng)至21天； (2) 細(xì)胞密度增加， 過(guò)去：1-2X106細(xì)胞／毫升， 現(xiàn)在：1-1.5X107細(xì)胞／毫升；,(3) 產(chǎn)量增加， 過(guò)去：10—20pg重組蛋白／細(xì)胞／天， 50一100mg重組蛋白／升， 現(xiàn)在：50-90pg重組蛋白／細(xì)胞／天，

43、 1-5g重組蛋白／升。,迄今為止，已有大約300種重組蛋白藥物正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，但在哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞中大規(guī)模生產(chǎn)的只有少數(shù)幾種：,b 干擾素g 干擾素,凝血因子VIII凝血因子IX,促紅細(xì)胞生成素（EPO）生長(zhǎng)因子（hGH）,白介素 2（IL-2）乙型肝炎表面抗原,單克隆抗體 CD4受體,組織型纖溶酶原激活劑（tPA）,利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)人源化的小鼠抗體,大多數(shù)惡性淋巴瘤細(xì)胞表面

44、上都有一種特異性的糖蛋白campath，用人源化的小鼠抗campath抗體治療非霍金淋巴細(xì)胞瘤患者，效果良好。重組抗體采用DHFR-MTX系統(tǒng)表達(dá)。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Neor,鼠金屬硫蛋白啟動(dòng)子,b 肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子,抗體輕鏈cDNA,b 肌動(dòng)蛋白終止子,pL,,,,,,,,,,,,,,,,dhfr,SV40啟動(dòng)子,b 肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子,抗體重鏈cDNA,b 肌動(dòng)蛋白終止子,pH,,,,,,,,,,,

45、,,,,,利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)人組織纖溶酶原激活劑,第一個(gè)由重組哺乳動(dòng)物,dhfr,啟動(dòng)子,人tPA cDNA,終止子,細(xì)胞規(guī)?；a(chǎn)的醫(yī)用蛋白,是治療急性心肌梗塞的溶血,栓藥物：人組織纖溶酶原激,活劑（tPA）。同樣采用,DHFR-MTX系統(tǒng)表達(dá)，受體,細(xì)胞選用CHO系統(tǒng)。目前，,用該工藝路線生產(chǎn)的重組人tPA已經(jīng)商品化。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,信號(hào)肽編碼序列,此外，人tPA也可由重組大腸

46、桿菌生產(chǎn)，但蛋白的重折疊效率低。,利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)人凝血因子VIII,凝血因子VIII編碼基因的缺陷與血友病密切相關(guān)。多年來(lái)，血友病病人都是使用從人血中分離純化的凝血因子VIII生物制品進(jìn)行治療，然而由于人的血源污染乙肝病毒或愛(ài)滋病病毒，數(shù)千名使用這種血液制品的血友病人慘遭感染，其中10%的病人最終死于愛(ài)滋病而非血友病。 早在上述情況發(fā)生之前，人凝血因子VIII的cDNA便已被克隆和鑒定，血源的污染則加速了利用基因工程技術(shù)

47、生產(chǎn)該藥物的進(jìn)程。與tPA相似，人凝血因子VIII也是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子，必須通過(guò)重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)，但目前商品化了的重組人凝血因子VIII尚不能滿足幾代血友病人的大量需求。,,,,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,以動(dòng)物個(gè)體為基因受體的基因表達(dá)技術(shù)，并由于這種外源基因的導(dǎo)入而產(chǎn)生可以遺傳的變異.這些遺傳改變包括：外源DNA至少整合到一條染色體上由于外源DNA的插入使任一基因發(fā)生改變由于外源DNA的插入使染色體發(fā)生重排有意識(shí)的導(dǎo)入可以持久存在的

48、遺傳實(shí)體,在各種器官和細(xì)胞中，乳腺組織可以進(jìn)行大規(guī)模的翻譯后修飾，并具有良好的滲透屏障。近年來(lái)，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的研究已經(jīng)成為生物工程領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，一般用來(lái)高效、高質(zhì)量生產(chǎn)具有生物活性的蛋白。但多數(shù)研究表明，乳腺特異性表達(dá)的成功率很低，蛋白在乳汁中的表達(dá)水平較低。,植物生物表達(dá)系統(tǒng),外源基因可以使用帶有分泌信號(hào)肽序列的植物體使重組蛋白分泌表達(dá)。利用植物做為生物反應(yīng)器生產(chǎn)的重組蛋白在折疊和組裝上與動(dòng)物細(xì)胞更為相似，從而具有與高等

49、動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的產(chǎn)物基本一致的免疫原性和生物活性，并且不會(huì)存在被動(dòng)物、病原體污染的可能性。,植物能夠表達(dá)來(lái)自動(dòng)物、細(xì)菌、病毒以及植物本身的蛋白質(zhì)易于大規(guī)模培養(yǎng)和生產(chǎn)，且在基因表達(dá)與修飾及安全性方面有特別的優(yōu)勢(shì)，因此利用植物生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)的研究展現(xiàn)了極其誘人的前景。多種抗體、酶、激紊、血漿蛋白和疫苗等都已通過(guò)基因工程的手段在植物的葉、莖、根、果實(shí)、種子以及植物細(xì)胞和器官中得到表達(dá)，然而提取與純化始終是大規(guī)模利用植物生產(chǎn)重組蛋白的主要障礙。

50、,Doloressa等據(jù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)肽在蛋白質(zhì)合成中的作用，把3種重組蛋白，即嗜熱細(xì)菌來(lái)源的木聚糖酶、水母的綠色熒光蛋白和人胎盤(pán)分泌的堿性磷酸酶(SEAP)定位到質(zhì)外體中，通過(guò)根分泌和葉分泌途徑獲得表達(dá)，從而建立了兩種新的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)--植物根分泌和葉分泌，簡(jiǎn)化了分離和純化程序，為利用轉(zhuǎn)基因植物大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白提供了潛在的途徑。雖然利用植物表達(dá)、生產(chǎn)外源性蛋白起步較晚，但目前已經(jīng)能夠利用植物生產(chǎn)多種醫(yī)用、食用以及工業(yè)用蛋白

51、及酶制劑。,無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),無(wú)細(xì)胞蛋蛋白合成系統(tǒng)是一種以外源DNA或mRNA為模板，利用細(xì)胞抽提物中的蛋白合成機(jī)器、蛋一折疊因子及其他相關(guān)酶系，通過(guò)添加氨基酸、T7聚合酶和能量物質(zhì)等來(lái)實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)表達(dá)的體外系統(tǒng)。其不受細(xì)胞核（核酸DNA/RNA)、線粒體、細(xì)胞骨架等的干擾，能夠在體外快速、大量表達(dá)蛋白。,1958年，Zamecnik首次證明，從細(xì)胞抽提物中獲得的翻譯機(jī)器可以介導(dǎo)體外的蛋白的合成；1961年，Nirenberg和Mattha

52、ei利用蛋白質(zhì)的無(wú)細(xì)胞合成體系，以破譯遺傳密碼子。,體外無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)分為原核和真核兩大類。原核系統(tǒng)以細(xì)菌裂解物為基礎(chǔ)，如大腸桿菌系統(tǒng)；真核系統(tǒng)以真核細(xì)胞裂解物為基礎(chǔ)，包括麥胚系統(tǒng)、昆蟲(chóng)系統(tǒng)、兔網(wǎng)織紅細(xì)胞系統(tǒng)等。這一真正的“開(kāi)放”系統(tǒng)，能夠特異性表達(dá)目的蛋白，產(chǎn)生的蛋白可用于蛋白質(zhì)功能檢測(cè)、結(jié)構(gòu)分析等下游實(shí)驗(yàn)。該系統(tǒng)應(yīng)用至今，已成功表達(dá)超過(guò)2 萬(wàn)種蛋白，其中包括13364 個(gè)人類的基因。,無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)與傳統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng)特點(diǎn)比

53、較,無(wú)細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)能夠表達(dá)其他表達(dá)系統(tǒng)很難表達(dá)的蛋白，如毒性蛋白、膜整合蛋白、生物活性肽。而且能更好的生產(chǎn)需要二硫鍵形成的外源蛋白，因?yàn)榱呀馕锏难趸€原條件可使用添加劑或改變還原劑/氧化劑的比例進(jìn)行調(diào)節(jié)。,主流的無(wú)細(xì)胞(cell free CF)表達(dá)策略為分層、分批提供新鮮組分到混合物中，消除混合物中副產(chǎn)物。在分批處理時(shí)，mRNA編碼的蛋白連續(xù)注入反應(yīng)物中，這可以提高產(chǎn)量，特別是當(dāng)反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、反應(yīng)規(guī)模大時(shí)，并且存在裂解液中核糖核酸酶

54、使靶標(biāo)mRNA降解可能性增加。,CF表達(dá)系統(tǒng)適用于膜蛋白的生產(chǎn)，溶解的膜蛋白在含有洗滌劑的CF反應(yīng)混合物中的表達(dá)可以重組到脂質(zhì)雙分子層中如脂質(zhì)體、雙層細(xì)胞和奈米圓盤(pán)。在這個(gè)過(guò)程中，在附帶脂質(zhì)清潔劑交換程序卜，自發(fā)的共轉(zhuǎn)化和翻譯后修飾方法被使用。,CF表達(dá)系統(tǒng)的易操作和高通量特性，能夠用于膜蛋白最佳增溶條件的篩選，缺點(diǎn)是不適合大量蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，因?yàn)榈鞍妆磉_(dá)水平比活宿主細(xì)胞的低，成木昂貴。,小結(jié)獲得具有大然結(jié)構(gòu)和足夠多的生物功能的蛋白質(zhì)

55、，以及發(fā)現(xiàn)新型蛋白分子對(duì)于實(shí)現(xiàn)藥物發(fā)現(xiàn)新突破尤為重要。重組蛋白技術(shù)使蛋白分子功能得以改善，蛋白純度有效提高。原核表達(dá)系統(tǒng)、真核表達(dá)系統(tǒng)、無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)以及其他蛋白生產(chǎn)方法的應(yīng)用，雖然尚存缺點(diǎn)，但其獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)應(yīng)該加以利用。,目前重組蛋白的表達(dá)和純化技術(shù)仍然需要克服困難并在研究過(guò)程中積累經(jīng)驗(yàn)，及時(shí)汲取相關(guān)領(lǐng)域的研究進(jìn)展，找出重組蛋白的制約因素，對(duì)癥下藥。隨著基因工程技術(shù)以及蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，重組蛋白技術(shù)將會(huì)越來(lái)越成熟，作為藥物分子的靶標(biāo)蛋白