高效表達(dá)PrP-GFP蛋白神經(jīng)細(xì)胞系的建立以及建立RNA干擾PrP蛋白表達(dá)技術(shù)的初步探索.pdf

1、宿主對朊毒體(prion)的敏感性與細(xì)胞型朊蛋白(PrPc)的表達(dá)量密切相關(guān)，表達(dá)量越高，對朊毒體越敏感。擁有高效表達(dá)PrPc的細(xì)胞系對朊毒體生物學(xué)研究具有十分重要的意義。為獲得這種對朊毒體敏感的細(xì)胞模型，本研究以Neuro-2a細(xì)胞為基礎(chǔ)，利用pCDNA3.1(-)真核表達(dá)載體，攜帶PrP/GFP融合基因，轉(zhuǎn)染至Neuro-2a細(xì)胞。經(jīng)熒光和抗性的雙重連續(xù)篩選，獲得了穩(wěn)定、高效表達(dá)PrPc的細(xì)胞系。 根據(jù)已公布的小鼠PrP基因

2、以及pEGFP載體的GFP基因序列設(shè)計(jì)引物，分別以小鼠基因組和pEGFP質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增PrP和GFP基因。將這兩個(gè)基因分別克隆到pGEM-T載體中，獲得pGEM-mPrP和pGEM-GFP兩個(gè)重組質(zhì)粒，進(jìn)行測序分析。分別用EcoRⅠ和BamHⅠ、BamHⅠ和HindⅢ以及EcoRⅠ和HindⅢ酶切pGEM-mPrP、pGEM-GFP和pCDNA3.1(-)質(zhì)粒，電泳、切膠回收。將這三個(gè)片段共連接，從而獲得融合mPrP/GFP基因

3、的真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1(-)-mPG。由于在PrPC-端融合了綠色熒光蛋白(GFP)，使該系統(tǒng)具備了早期篩選的標(biāo)簽。用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Neuro-2a神經(jīng)細(xì)胞，用G418抗性篩選、熒光顯微鏡檢測、Western-Blotting檢測、PCR檢測、連續(xù)傳代法篩選能夠穩(wěn)定、高效表達(dá)PrP/GFP蛋白的細(xì)胞株。本實(shí)驗(yàn)成功獲得了一株高效表達(dá)PrP/GFP蛋白的Neuro-2a細(xì)胞株(命名為mPGN2

4、a)，為朊毒體的研究提供了較理想的細(xì)胞模型。RNA干擾(RNAi)技術(shù)能夠高效、特異的抑制目的蛋白的表達(dá)，因此是一種有利的蛋白功能研究技術(shù)。為便于PrP功能研究，本實(shí)驗(yàn)初步探索了利用載體表達(dá)shRNA的方法干擾PrP表達(dá)。 以小鼠PrP編碼基因?yàn)榘谢?，設(shè)計(jì)針對PrP的干擾片段。在該片段兩端添加ApaⅠ和EcoRⅠ粘性末端作為接頭，用ApaⅠ和EcoRⅠ酶切載體pSilenceU6-1.0。將干擾片段與載體共連接，構(gòu)成重組質(zhì)粒。