GFP-α-tubulin-GFP-CENP-A-HeLa細(xì)胞系的建立及其功能評(píng)價(jià).pdf

1、腫瘤作為慢性非傳染疾病已成為危害人類健康并導(dǎo)致死亡的頭號(hào)殺手，世衛(wèi)組織發(fā)布的最新癌癥報(bào)告顯示惡性腫瘤發(fā)病率與死亡率依然呈現(xiàn)迅猛增長(zhǎng)的趨勢(shì)。因此從細(xì)胞分子水平研究腫瘤的發(fā)生機(jī)制，為腫瘤的治療及預(yù)防奠定基礎(chǔ)有著迫切的需要。隨著近年來(lái)分子影像學(xué)的發(fā)展，高分辨高速的活細(xì)胞成像顯微鏡系統(tǒng)日益成熟，這就為從細(xì)胞層面動(dòng)態(tài)研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了強(qiáng)有力的工具。而如何應(yīng)用該技術(shù)，達(dá)到篩查治療腫瘤有效化學(xué)藥物的目標(biāo)，迫切需要構(gòu)建一種能夠反映化療藥物是否

2、損傷腫瘤細(xì)胞的、穩(wěn)定表達(dá)微管和著絲粒相關(guān)蛋白質(zhì)的熒光報(bào)告細(xì)胞系模型，通過(guò)觀察腫瘤細(xì)胞的行為變化，為腫瘤的治療提供有效的化療藥物篩查的工具。
　　細(xì)胞周期的錯(cuò)誤調(diào)節(jié)可以導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。細(xì)胞周期中的有絲分裂過(guò)程是一個(gè)精細(xì)調(diào)節(jié)的過(guò)程，其中每一對(duì)染色體都需要正確的連接來(lái)自于兩極的微管，如果著絲粒與微管的附著錯(cuò)誤就會(huì)導(dǎo)致染色體的排列錯(cuò)誤，進(jìn)而導(dǎo)致染色體分離的異常，促進(jìn)染色體不穩(wěn)定性的發(fā)生，最終產(chǎn)生非整倍體的細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。為了更直觀的

3、精確研究染色體與微管的運(yùn)動(dòng)結(jié)合過(guò)程，預(yù)期構(gòu)建標(biāo)記GFP綠色熒光蛋白質(zhì)的微管和著絲粒相關(guān)蛋白質(zhì)的腫瘤細(xì)胞系，從而利用活細(xì)胞顯微工作站來(lái)研究不同的化療藥物損傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制，為進(jìn)一步研究腫瘤發(fā)生及篩查腫瘤化療藥物奠定基礎(chǔ)。
　　目的：
　　1.應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá) GFP綠色熒光蛋白質(zhì)的微管和著絲粒相關(guān)蛋白質(zhì)的腫瘤細(xì)胞模型。
　　2.應(yīng)用GFP-α-tubulin/GFP-CENP-A-HeLa細(xì)胞模型，觀察細(xì)

4、胞周期變化，來(lái)評(píng)價(jià)微管相關(guān)化療藥效果及機(jī)制。
　　方法：
　　1.分子克隆構(gòu)建慢病毒相關(guān)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞中收集上清最終獲得可用于感染的慢病毒。
　　2.利用胸苷阻滯的細(xì)胞同步化方法獲得G1期阻滯的細(xì)胞，釋放后進(jìn)入有絲分裂期前進(jìn)行活細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀察。
　　3.利用實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)活細(xì)胞工作站來(lái)動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞有絲分裂的進(jìn)程。
　　4.將細(xì)胞中加入Nocodazole及 Taxol化療藥，觀察微管動(dòng)態(tài)變化及細(xì)胞凋亡的進(jìn)

5、程。
　　結(jié)果：
　　1.通過(guò)分子克隆技術(shù)成功將表達(dá)CENP-A/α-tubulin片段插入到表達(dá)GFP的慢病毒載體中。利用293T細(xì)胞產(chǎn)生慢病毒并最終成功獲得表達(dá)GFP-CENP-A/α-tubulin的HeLa細(xì)胞系。
　　2.通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察到在間期細(xì)胞中，存在微管結(jié)構(gòu)綠色熒光表達(dá)，提示該細(xì)胞系可用于活細(xì)胞觀察。
　　3.建立了基于HeLa細(xì)胞系的化學(xué)藥物同步化方法，成功地將HeLa細(xì)胞周期阻滯于G

6、1期，并通過(guò)釋放得到了處于G1/S,S,G2/M各個(gè)周期的細(xì)胞，為活細(xì)胞觀察奠定基礎(chǔ)。
　　4.利用Time-Lapse活細(xì)胞工作站，對(duì)表達(dá)GFP-CENP-A/α-tubulin的HeLa細(xì)胞系進(jìn)行同步化后在有絲分裂期進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，成功地觀察到了微管與著絲粒的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。
　　5.通過(guò)比較GFP-CENP-A/α-tubulin的HeLa細(xì)胞與正常細(xì)胞的有絲分裂進(jìn)程，提示兩者在細(xì)胞分裂時(shí)間上并無(wú)顯著性差別，提示該細(xì)胞的細(xì)

7、胞周期是正常的，因此可用于進(jìn)一步的功能評(píng)價(jià)。
　　6.利用Time-Lapse活細(xì)胞工作站動(dòng)態(tài)觀察了解聚藥加入及撤離細(xì)胞后，微管的重新生長(zhǎng)過(guò)程，此結(jié)果表明GFP-CENP-A/α-tubulin已經(jīng)穩(wěn)定整合于HeLa細(xì)胞基因組中，提示該細(xì)胞可以作為開(kāi)展針對(duì)微管的化療藥作用機(jī)制研究的強(qiáng)大工具。
　　結(jié)論：
　　成功構(gòu)建了慢病毒轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)標(biāo)記綠色熒光蛋白質(zhì)的著絲粒(GFP-CENP-A)與微管(GFP-α-tub uli