轉(zhuǎn)核技術(shù)建立可增殖神經(jīng)細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：將胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞核轉(zhuǎn)入到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞胞質(zhì)體中構(gòu)建轉(zhuǎn)核細(xì)胞，以期望建立一種可增殖的神經(jīng)細(xì)胞系，為腦移植的供體細(xì)胞來(lái)源探索一條新的途徑。 方法：(1)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44、CD90、CD71、CD11b進(jìn)行鑒定，用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)CD133的表達(dá)情況；(2)用梯度離心法制備骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞胞質(zhì)體，并用HE染色、Giemsa染色、免疫熒光雙標(biāo)法、透射電鏡檢查等方

2、法進(jìn)行鑒定，用臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)其活性；(3)采用胎齡17d的胎鼠進(jìn)行皮質(zhì)神經(jīng)元的分離培養(yǎng)，用免疫組化法檢測(cè)神經(jīng)元MAP2和NeuN的表達(dá)情況；(4)用梯度離心法制備神經(jīng)元細(xì)胞核，并用HE染色、免疫熒光染色、透射電鏡檢查等方法進(jìn)行鑒定，用臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)其活性；(5)用PEG介導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞核與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞胞質(zhì)體發(fā)生融合構(gòu)建轉(zhuǎn)核細(xì)胞；(6)用Hoechst33342和CD71免疫熒光雙標(biāo)法對(duì)轉(zhuǎn)核細(xì)胞進(jìn)行鑒定；(7)用抗BrdU和Hoechs

3、t33342免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)轉(zhuǎn)核細(xì)胞是否具有增殖能力，用MTT比色法繪制生長(zhǎng)曲線：(8)用掃描電鏡和透射電鏡對(duì)轉(zhuǎn)核細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)；(9)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)核細(xì)胞CD44、CD90、CD71、CD11b等抗原的表達(dá)變化；(10)用免疫熒光雙標(biāo)法和免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)轉(zhuǎn)核細(xì)胞NeuN的表達(dá)情況；(11)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)轉(zhuǎn)核細(xì)胞CD133、MAP2、Nestin等抗原的表達(dá)情況； 結(jié)果：(1)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形、漩渦狀

4、生長(zhǎng)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44、CD90、CD71陽(yáng)性，CD11b陰性，免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示CD133陰性。 (2)HE染色和Giemsa染色顯示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)梯度離心后在15～18％Ficoll400梯度層可見(jiàn)到大量胞質(zhì)體，貼壁生長(zhǎng)的胞質(zhì)體呈多邊形或類圓形，體積與完整細(xì)胞相比差別不大。Hoechst33342和CD71免疫熒光雙標(biāo)染色顯示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)梯度離心后在15～18％Fieoll400

5、梯度層可見(jiàn)到胞漿呈綠色熒光的胞質(zhì)體，胞核所在部位無(wú)藍(lán)色熒光顯示。臺(tái)盼藍(lán)染色示活胞質(zhì)體比例為99.5％。12.5～18％Ficoll400梯度層細(xì)胞透射電鏡標(biāo)本可觀察到只有胞漿成分的圓形胞質(zhì)體，胞漿中有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等超微結(jié)構(gòu)。 (3)胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元呈多角形，伸出多個(gè)突起，MAP2染色顯示神經(jīng)元細(xì)胞漿和突起呈免疫反應(yīng)陽(yáng)性，NeuN染色顯示神經(jīng)元細(xì)胞核呈免疫反應(yīng)陽(yáng)性，部分核周胞質(zhì)和部分近端突起也呈免疫反應(yīng)陽(yáng)性。在培養(yǎng)6h、3d、6d

6、時(shí)MAP2和NeuN陽(yáng)性細(xì)胞比例均在90％左右，培養(yǎng)不同時(shí)間免疫陽(yáng)性細(xì)胞比例無(wú)顯著性差異。 (4)HE染色和Hoechst免疫熒光染色顯示神經(jīng)元梯度離心后在22～30％ Ficoll400梯度層可見(jiàn)到大量圓點(diǎn)狀細(xì)胞核，臺(tái)盼藍(lán)染色顯示活細(xì)胞核比例為99.6％。在22～30％Ficoll400梯度層細(xì)胞透射電鏡標(biāo)本中可觀察到圓形的細(xì)胞核，在細(xì)胞核的周圍僅見(jiàn)到一層薄薄的胞漿成分。 (5)用PEG可介導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞核與骨髓問(wèn)充質(zhì)干

7、細(xì)胞胞質(zhì)體融合構(gòu)建轉(zhuǎn)核細(xì)胞，轉(zhuǎn)核細(xì)胞呈梭形或多邊形，少數(shù)細(xì)胞長(zhǎng)出兩個(gè)或數(shù)個(gè)突起，部分轉(zhuǎn)核細(xì)胞呈球狀聚集生長(zhǎng)。 (6)轉(zhuǎn)核細(xì)胞Hoechst33342和CD71免疫熒光雙標(biāo)陽(yáng)性，提示細(xì)胞核來(lái)自神經(jīng)元，細(xì)胞漿來(lái)自骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。轉(zhuǎn)核效率為64.8％。 (7)轉(zhuǎn)核細(xì)胞抗BrdU與Hoechst33342免疫熒光雙標(biāo)染色陽(yáng)性。細(xì)胞傳代次數(shù)和細(xì)胞培養(yǎng)天數(shù)對(duì)轉(zhuǎn)核細(xì)胞MTT值變化具有顯著性影響(p<0.01)。二代和三代轉(zhuǎn)核細(xì)胞MT

8、T值與一代轉(zhuǎn)核細(xì)胞相比明顯增高(p<0.05)。轉(zhuǎn)核細(xì)胞培養(yǎng)第4天的MTT值較培養(yǎng)第1天的MTT值明顯增高，具有顯著性差異(p<0.05)。 (8)掃描電鏡可觀察到神經(jīng)元細(xì)胞核與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞胞質(zhì)體發(fā)生融合的過(guò)程。透射電鏡可觀察轉(zhuǎn)核細(xì)胞核漿比偏大，核膜有較多皺褶，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量多，體積比較寬大。 (9)一至四代轉(zhuǎn)核細(xì)胞CD71、CD90呈陽(yáng)性，CD11b呈陰性，一代轉(zhuǎn)核細(xì)胞CD44為陰性，隨著傳代次數(shù)的增加CD44陽(yáng)性細(xì)胞

9、率逐漸增加，至第四代時(shí)CD44陽(yáng)性細(xì)胞率達(dá)98.5％。 (10)大多數(shù)轉(zhuǎn)核細(xì)胞的胞漿NeuN均呈免疫陽(yáng)性反應(yīng)，部分轉(zhuǎn)核細(xì)胞胞漿NeuN呈免疫陽(yáng)性反應(yīng)，胞核呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，另有少數(shù)轉(zhuǎn)核細(xì)胞僅胞核部位NeuN呈強(qiáng)陽(yáng)性。第二代轉(zhuǎn)核細(xì)胞NeuN表達(dá)較第一代轉(zhuǎn)核細(xì)胞明顯增加(p<0.05)，繼續(xù)傳代NeuN表達(dá)逐漸下降，第四代轉(zhuǎn)核細(xì)胞NeuN表達(dá)與第二代轉(zhuǎn)核細(xì)胞相比明顯下降(p<0.05)。 (11)部分轉(zhuǎn)核細(xì)胞的細(xì)胞膜上出現(xiàn)Nes

10、tin陽(yáng)性表達(dá)。一至四代轉(zhuǎn)核細(xì)胞Nestin表達(dá)強(qiáng)弱比較無(wú)明顯差異(0>0.05)，但陽(yáng)性細(xì)胞比例逐漸增加。轉(zhuǎn)核細(xì)胞胞漿中CD133表達(dá)陽(yáng)性，一至四代轉(zhuǎn)核細(xì)胞CD133表達(dá)水平無(wú)顯著性差異(p>0.05)。第一代轉(zhuǎn)核細(xì)胞胞漿中MAP2呈免疫陽(yáng)性反應(yīng)，隨傳代次數(shù)增加表達(dá)水平逐漸減弱，第四代轉(zhuǎn)核細(xì)胞MAP2表達(dá)呈陰性反應(yīng)。 結(jié)論：(1)用梯度離心法可制備骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞胞質(zhì)體；(2)用梯度離心法可制備胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞核；(3)采甩