實(shí)驗(yàn)細(xì)胞-神經(jīng)細(xì)胞

1、神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng),,在神經(jīng)生理、生化和神經(jīng)藥理的研究中、神經(jīng)細(xì)胞的體外培養(yǎng)日益受到重視，因?yàn)樗茄芯繂蝹€(gè)神經(jīng)細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)的適宜方法。在體外培養(yǎng)條件下背根神經(jīng)節(jié)、頸上交感節(jié)、胚胎脊髓和不同腦區(qū) (海馬、下丘腦、大腦皮層、小腦和垂體細(xì)胞等)培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)特征都不盡相同，這與它們具有不同功能有關(guān)。交感和感覺(jué)神經(jīng)元以及不同腦區(qū)神經(jīng)元的體外培養(yǎng)成功, 為我們深入研究它們的結(jié)構(gòu)和功能提供了合適的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?一、神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)主要優(yōu)點(diǎn):,1. 分散培

2、養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞在體外生長(zhǎng)成熟后，能保持結(jié)構(gòu)和功能上的某些特點(diǎn)，而且長(zhǎng)期培養(yǎng)能形成髓鞘和建立突觸聯(lián)系，這就提供了體內(nèi)生長(zhǎng)過(guò)程在體外重現(xiàn)的機(jī)會(huì)。 2. 能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)直接觀察活細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、形態(tài)和功能變化，便于使用各種不同的技術(shù)方法如相差顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、同位素標(biāo)記、原位雜交、免疫組化和電生理等手段進(jìn)行研究。 3. 易于施行物理（如缺血、缺氧）、化學(xué)和生物因子（如神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子）等實(shí)

3、驗(yàn)條件，觀察條件變更對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的直接或間接作用。 4. 便于從細(xì)胞和分子水平探討某些神經(jīng)疾病的發(fā)病機(jī)制，藥物或各種因素對(duì)胚胎或新生動(dòng)物神經(jīng)細(xì)胞在生長(zhǎng)、發(fā)育和分化等各方面的影響。,,（一）神經(jīng)細(xì)胞的原代培養(yǎng)： 原代培養(yǎng)（primary culture）是指從活體上獲得細(xì)胞、組織或器官在體外條件下進(jìn)行的第一次培養(yǎng)。（二）神經(jīng)細(xì)胞系培養(yǎng) 大多數(shù)細(xì)胞經(jīng)重復(fù)傳代一定數(shù)量（一般為20-80代）將停止分

4、裂，即開(kāi)始進(jìn)入衰老的過(guò)程。然而，也有某些細(xì)胞群可無(wú)限傳代，并表現(xiàn)出相當(dāng)穩(wěn)定的表型，成為連續(xù)細(xì)胞系（continuous cell line）。 在過(guò)去的30多年中，己經(jīng)從神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中克隆出許多細(xì)胞株，如神經(jīng)母細(xì)胞瘤( neurblastoma )、神經(jīng)膠質(zhì)瘤（glioma）、嗜鉻細(xì)胞瘤(pheochromocytoma)等細(xì)胞株。,二、神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)類(lèi)型：,原代神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的類(lèi)型：,,1．雞胚背根神經(jīng)節(jié)組織塊培養(yǎng)；2．

5、新生大鼠、新生小鼠及雞胚背根神經(jīng)節(jié)分散細(xì)胞培養(yǎng)；3．新生小鼠頸上交感神經(jīng)元分散細(xì)胞培養(yǎng)；4．胚胎小鼠、大鼠、雞胚脊髓腹角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元培養(yǎng)；5．新生大鼠海馬神經(jīng)元分散培養(yǎng)； 6．新生大鼠隔神經(jīng)元分散培養(yǎng)； 7．新生大鼠下丘腦神經(jīng)元分散培養(yǎng)；8．新生大鼠大腦皮層神經(jīng)元分散培養(yǎng)；9．新生大鼠紋狀體神經(jīng)元培養(yǎng)；10．新生大鼠中腦黑質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)；11．新生大鼠小腦神經(jīng)神經(jīng)元培養(yǎng)；12．新生大鼠腦腺垂體細(xì)胞培養(yǎng)；13．神經(jīng)膠

6、質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)；14．成年大鼠背根節(jié)神經(jīng)元分散培養(yǎng)；15．海馬腦片培養(yǎng)；16．新生大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)。,（一）神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng),,1．雪旺細(xì)胞： 雪旺細(xì)胞是外周神經(jīng)系統(tǒng)最主要的膠質(zhì)細(xì)胞，也是外周神經(jīng)的成髓鞘細(xì)胞；它形成髓鞘，或包裹軸突而不形成髓鞘。雪旺細(xì)胞的功能極其活躍，一旦神經(jīng)受損，它能分裂增殖，分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞粘附分子，對(duì)神經(jīng)元及其軸突起營(yíng)養(yǎng)和修復(fù)作用。近年來(lái)的研究表明，雪旺細(xì)胞也能促進(jìn)中

7、樞神經(jīng)對(duì)脫髓鞘損傷的修復(fù)，如對(duì)脊髓的再生，對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)以及對(duì)隔-海馬通路再生等。說(shuō)明雪旺細(xì)胞能改善中樞神經(jīng)再生的微環(huán)境，因而近年來(lái)對(duì)雪旺細(xì)胞的研究，尤其是體外培養(yǎng)研究已成熱點(diǎn)。,材料和方法,,雪旺細(xì)胞培養(yǎng)材料：各類(lèi)哺乳動(dòng)物的外周神經(jīng)和背根神經(jīng)節(jié)，孵化8-12d雞胚、出生1-3d 的小鼠或大鼠和人工流產(chǎn)的人胎兒。 無(wú)菌用解剖鑷分離出神經(jīng)節(jié)，剝除神經(jīng)節(jié)被膜, 用0.125%胰蛋白酶消化(37℃ 30min)后用培養(yǎng)液（90%D

8、MEM，10%胎牛血清，2mM谷氨酰胺）吹打分散成細(xì)胞懸液，先接種于玻璃培養(yǎng)瓶中，于培養(yǎng)箱中孵育30min后，翻轉(zhuǎn)瓶子吸出細(xì)胞懸液，除去已貼壁的成纖維細(xì)胞，再接種于涂有鼠尾膠的35mm塑料培養(yǎng)皿中, 種植密度為0.2×105 個(gè)細(xì)胞/ml，每皿2ml細(xì)胞懸液。 36℃、10%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種第3 d, 在培養(yǎng)皿中分別加入細(xì)胞分裂抑制劑5-氟-2'-脫氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml，以進(jìn)一

9、步去除成纖維細(xì)胞, 作用48小時(shí)后更換新鮮培養(yǎng)液，以后每周換液兩次, 每次更換一半新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液。,雪旺細(xì)胞的生長(zhǎng)和形態(tài)特征,,培養(yǎng)15d后可獲得較高純度的雪旺細(xì)胞，雪旺細(xì)胞呈雙極梭狀，核卵居中，相互平行排列，經(jīng)S-100免疫組織化學(xué)染色呈陽(yáng)性反應(yīng)。增殖分裂的雪旺細(xì)胞可用于進(jìn)一步傳代培養(yǎng)，也可進(jìn)行冷凍保存?zhèn)溆谩?2．星形膠質(zhì)細(xì)胞,,星形膠質(zhì)細(xì)胞是膠質(zhì)細(xì)胞中體積最大，數(shù)量最多的一種，胞體呈星形，核大，呈卵圓形，染色質(zhì)稀少。

10、 星形膠質(zhì)細(xì)胞分兩類(lèi)： 原漿性星形膠質(zhì)細(xì)胞： 突起短粗，分枝多。 纖維性星形膠質(zhì)細(xì)胞：突起細(xì)長(zhǎng)，分枝少。與少突膠質(zhì)細(xì)胞源自同一前體細(xì)胞。,,,星形膠質(zhì)細(xì)胞具有多種功能： ● 充填空隙，起結(jié)構(gòu)的支持作用 ● 突起構(gòu)成血腦屏障 ● 攝取和代謝某些神經(jīng)遞質(zhì)如γ-氨基丁酸等 ● 調(diào)節(jié)局部神經(jīng)遞質(zhì)的濃度，使神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)能平穩(wěn)地發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)K+的水平而影響神經(jīng)元的電生理活動(dòng)；

11、 ● 能合成和分泌大量神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，有維持神經(jīng)元生存和促進(jìn)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的作用，亦能分泌IL、TNF、和干擾素等多種細(xì)胞因子； ● 有分裂能力，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，星形膠質(zhì)細(xì)胞增生、肥大，填補(bǔ)缺損，形成膠質(zhì)瘢痕。,方法和結(jié)果：,,選擇出生 2 d 的SD大鼠，無(wú)菌條件下分離出大腦皮層，用0.125%胰蛋白酶消化 (37℃ 30min) 后用培養(yǎng)液（ 90% DMEM，10 % 胎牛血清，2mM谷氨酰胺）吹打分散成細(xì)

12、胞懸液，先接種于玻璃培養(yǎng)瓶中，于培養(yǎng)箱中孵育30 min后，翻轉(zhuǎn)瓶子吸出細(xì)胞懸液，除去已貼壁的成纖維細(xì)胞，再接種于涂有鼠尾膠的75cm2塑料培養(yǎng)瓶中, 種植密度為1×105 個(gè)細(xì)胞/cm2，每瓶10ml細(xì)胞懸液置。置36℃、10%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每周換液2 次，培養(yǎng)10-14h，細(xì)胞分為兩層，下一層為I型膠質(zhì)細(xì)胞即原漿形膠質(zhì)細(xì)胞，上一層是O-2A前體細(xì)胞，根據(jù)兩類(lèi)細(xì)胞貼壁能力的差異，以振蕩培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行分選，在37℃搖床上振

13、蕩，16 h（180r/min）O-2A前體細(xì)胞可被搖下來(lái)，搖下來(lái)的細(xì)胞種植在涂有鼠尾膠的75mcm2塑料培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液使用20 % 胎牛血清促進(jìn)O-2A前體細(xì)胞分化為II型膠質(zhì)細(xì)胞即纖維型膠質(zhì)細(xì)胞。可分裂增殖的原漿形膠質(zhì)細(xì)胞和纖維型膠質(zhì)細(xì)胞可用于進(jìn)一步傳代培養(yǎng)，也可進(jìn)行冷凍保存?zhèn)溆谩?,,純度鑒定可用膠質(zhì)纖維酸性蛋白抗體 （GFAP）染色確定。,（二）成年大鼠背根節(jié)神經(jīng)元培養(yǎng),,● 材料和方法 取3-6 月齡的S

14、D雄性大鼠。 無(wú)菌剪取一段脊髓，背側(cè)朝上于滅菌毛玻璃片上，在解剖顯微鏡下沿椎管兩側(cè)水平剪除腹側(cè)一半椎骨，暴露脊髓和神經(jīng)節(jié)， 取出神經(jīng)節(jié)。 置于含 1% 膠元酶(Collagenase)和1% 消化酶(Dispase)的2ml混合消化液中消化(37℃， 1 h)。 分散后用種植(Plating)培養(yǎng)液稀釋成0.2×105個(gè)細(xì)胞/ml密度的細(xì)胞懸液；接種于涂有小牛皮膠或以小鼠腦皮層膠

15、質(zhì)細(xì)胞為背景的35mm塑料培養(yǎng)皿中，每皿置2ml細(xì)胞懸液。 標(biāo)本于36℃、10%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后傾去培養(yǎng)皿內(nèi)種植培養(yǎng)液，改用飼養(yǎng)(Feeding)培養(yǎng)液培養(yǎng)。 接種第3天, 在培養(yǎng)皿中分別加入細(xì)胞分裂抑制劑5-氟-2-脫氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml, 作用48小時(shí)后更換新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液，以后每周換液兩次，每次更換一半新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液。,成年大鼠背根節(jié)神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化和形態(tài)特征,,成年大

16、鼠背根節(jié)神經(jīng)元在含 NGF 的培養(yǎng)液中種植后4h, 細(xì)胞即開(kāi)始貼附在膠元薄膜層上生長(zhǎng)，背根節(jié)神經(jīng)元的胞體一般為圓形，有時(shí)亦可見(jiàn)橢圓或梭形，體積較大, 直徑約8-14μm左右，胞體周?chē)尸F(xiàn)一圈光暈，神經(jīng)元的細(xì)胞核大多偏于胞體一側(cè)，核仁明顯。接種后24h，部分貼壁存活神經(jīng)元開(kāi)始長(zhǎng)出突起。培養(yǎng)2-3天后，神經(jīng)元突起逐漸增多并延長(zhǎng), 形成稀疏的網(wǎng)絡(luò)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，神經(jīng)突起網(wǎng)絡(luò)變得更加稠密。神經(jīng)細(xì)胞的主干和分枝明顯延長(zhǎng)并增粗，神經(jīng)元的胞體逐

17、漸增大。成年大鼠背根節(jié)神經(jīng)元可維持培養(yǎng)2周。,（三）海馬腦片培養(yǎng),,材料和方法,,出生4-7d的Wistar大鼠 無(wú)菌取腦、分離出雙側(cè)海馬，用雙面刀片垂直于海馬長(zhǎng)軸將其切成厚約400μm左右的腦薄片，接種于涂有小牛皮膠的35mm塑料培養(yǎng)皿中，每皿按切片順序按Z字形接種10個(gè)腦片, 置腦片于36℃濕盒內(nèi)孵育2h，使腦片較牢固地貼附在膠原上，然后加入1.5ml飼養(yǎng)培養(yǎng)液，在36℃、含10%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

18、 接種第5 d，在培養(yǎng)皿中分別加入細(xì)胞分裂抑制劑5 -氟- 2-脫氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml或加入阿糖胞苷 3μg/ml以抑制非神經(jīng)細(xì)胞的過(guò)度增殖, 作用48h 后更換新鮮培養(yǎng)液，以后每周換液2次，每次更換50%新鮮培養(yǎng)液。,海馬腦片培養(yǎng)神經(jīng)元的生長(zhǎng)分化和形態(tài)特征,,海馬腦片種植后 24h，可見(jiàn)少數(shù)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞開(kāi)紿從海馬腦片的不同區(qū)域向外纖移生長(zhǎng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，可見(jiàn)不同腦區(qū)越來(lái)越多的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞向外纖

19、移生長(zhǎng)，并形成密集的網(wǎng)絡(luò)。當(dāng)加入細(xì)胞分裂抑制劑抑制膠質(zhì)細(xì)胞增殖后，可以獲得較純的不同腦區(qū)的培養(yǎng)神經(jīng)元。,（四）新生大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng),,干細(xì)胞是指在一定時(shí)期具有自我更新能力和廣泛發(fā)育潛能的細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)是近年來(lái)神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的重大突破，神經(jīng)干細(xì)胞的研究成了近期研究的熱點(diǎn)，不僅因?yàn)槠渚哂醒芯可窠?jīng)系統(tǒng)發(fā)育的重要性，更主要的是其潛在的治療價(jià)值；神經(jīng)干細(xì)胞研究的主要難點(diǎn)是不能在體內(nèi)將它們與其它細(xì)胞分開(kāi)，故通常采用在體外培養(yǎng)一段時(shí)間

20、后形成細(xì)胞克隆，分離出神經(jīng)干細(xì)胞。體外培養(yǎng)可增殖，獲得大量神經(jīng)干細(xì)胞，這些細(xì)胞若能被誘導(dǎo)分化為某種特異神經(jīng)元，用以代替損傷神經(jīng)元，這將為神經(jīng)再生和功能重建提供充足而理想的移植材料。,材料和方法,,取當(dāng)天出生的Wistar大鼠，在無(wú)菌條件下分離出雙側(cè)海馬，用0.125%胰蛋白酶消化(36℃、30min)分散后，用培養(yǎng)液（98% DMEM或F12， 1% 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素，1% 谷氨酰胺，BFGF 20μg/L，EGF 20μg/L）吹打分散制成

21、細(xì)胞懸液，接種于75cm2塑料培養(yǎng)瓶中， 種植密度為1×105 個(gè)細(xì)胞/cm2，每瓶10ml細(xì)胞懸液。置36℃、10%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。原代克隆形成后再次機(jī)械分離克隆制作單細(xì)胞懸液，接種于75cm2塑料培養(yǎng)瓶中。此后每周機(jī)械分離克隆傳代1次，方法同前。,新生大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞的生長(zhǎng)和形態(tài)特征,,新生大鼠海馬細(xì)胞在上述無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng) 2d后，大部細(xì)胞死亡，部分細(xì)胞分裂形成，2-4個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞團(tuán)逐

22、漸增大，細(xì)胞團(tuán)數(shù)目逐漸多?？捎糜谶M(jìn)一步傳代培養(yǎng)也可進(jìn)行冷凍保存?zhèn)溆谩?純度鑒定可用Nestin染色確定。,,NSE,GFAP,海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)10天 免疫組化鑒定,（五） 海馬神經(jīng)元的無(wú)血清培養(yǎng),,無(wú)血清神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)研究越來(lái)越受到科學(xué)家們重視，主要原因： （1）在進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)研究時(shí)，由于血清成份復(fù)雜且不穩(wěn)定，妨礙對(duì)神經(jīng)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)要求的確切了解。 （2）在進(jìn)行激素和藥物研究時(shí)，血清成份與激素或

23、藥物結(jié)合的結(jié)果，干擾了其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的作用。 （3）干擾對(duì)培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞釋放產(chǎn)物的分析。 （4）血清只能過(guò)濾消毒，過(guò)濾消毒只能除去細(xì)菌，但不能除去血清中可能含有的病毒和支原體。 因此，人們期望用不含血清的的培養(yǎng)液培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞?，F(xiàn)將兩種無(wú)血清培養(yǎng)海馬神經(jīng)細(xì)胞的方法介紹如下：,材料與方法：,,取當(dāng)天出生的Wistar大鼠，在無(wú)菌條件下分離出雙側(cè)海馬。用0.125%胰蛋白酶消化(36℃、30min)分散后，

24、用種植培養(yǎng)液(79% DMEM/F12，10%馬血清，10% 胎牛血清，1%谷氨酰胺)，稀釋成5×106個(gè)細(xì)胞/ml密度的細(xì)胞液， 接種于涂有小牛皮膠的35mm塑料培養(yǎng)皿中，每皿2ml，置標(biāo)本于36℃、含10%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24h后頃去培養(yǎng)皿內(nèi)種植培養(yǎng)液，改用無(wú)血清飼養(yǎng)培養(yǎng)液(98% DMEM/F12， 1% 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素，1% 谷氨酰胺)培養(yǎng)。接種第10 d，在培養(yǎng)皿中分別加入細(xì)胞分裂抑制劑5-氟- 2-脫氧尿苷15μ

25、g/ml和尿苷35μg/ml或加入阿糖胞苷 3μg/ml以抑制非神經(jīng)細(xì)胞的增殖，作用48h 后更換新鮮培養(yǎng)液，以后每周換液2次，每次更換50%新鮮無(wú)血清培養(yǎng)液。,,2．新生大鼠海馬神經(jīng)元無(wú)血清培養(yǎng)時(shí) 的生長(zhǎng)分化和形態(tài)特征,新生大鼠海馬神經(jīng)元種植后12h，大部分細(xì)胞可貼壁，呈圓形，其中少數(shù)神經(jīng)細(xì)胞開(kāi)始伸出1-2個(gè)突起。培養(yǎng)24h后，伸出突起的神經(jīng)細(xì)胞逐漸增多, 突起一般為20-40μm，長(zhǎng)者可達(dá)60μm。改用無(wú)血清飼養(yǎng)培養(yǎng)液培

26、養(yǎng)3d后, 神經(jīng)元突起進(jìn)一步增多并延長(zhǎng)，形成稀疏的網(wǎng)絡(luò)。培養(yǎng)的海馬細(xì)胞以錐體細(xì)胞為多見(jiàn)，胞體較大，直徑6-12μm。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，神經(jīng)元胞體逐漸增大，胞突主干和分技明顯延長(zhǎng)并增粗，形成更加稠密的網(wǎng)絡(luò)。海馬神經(jīng)元在體外可維持無(wú)血清培養(yǎng) 1個(gè)月。,,,三、神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的注意事項(xiàng),1 NGF是必不可少的營(yíng)養(yǎng)因子,,在背根節(jié)神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，早期感覺(jué)神經(jīng)元發(fā)育階段，NGF是必不可少的營(yíng)養(yǎng)因子，但在培養(yǎng)后期，神經(jīng)元已發(fā)育成熟，可能非神

27、經(jīng)細(xì)胞分泌的極少量NGF即能滿足神經(jīng)元生長(zhǎng)需要，因此不另加NGF也能維持長(zhǎng)期培養(yǎng)。 在上頸交感節(jié)細(xì)胞分散培養(yǎng)過(guò)程中，若最初1-2d在培養(yǎng)液中缺乏 NGF，交感神經(jīng)元突起不見(jiàn)生長(zhǎng)，且大多死亡。培養(yǎng)15d或1個(gè)月時(shí)，如果培養(yǎng)液中未加入NGF，本來(lái)生長(zhǎng)良好的神經(jīng)元很快便出現(xiàn)顆粒變性或空泡， 逐漸死亡。表明NGF對(duì)于促進(jìn)神經(jīng)突起生長(zhǎng)和維持神經(jīng)元生存有顯著作用。,2 細(xì)胞接種密度,,在神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育受到多

28、種因素的影響，其中細(xì)胞接種密度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育影響較大，一般神經(jīng)細(xì)胞的接種密度以0.5-1×106 個(gè)細(xì)胞/ml密度為宜，如每毫升中超過(guò)3×106個(gè)細(xì)胞/ml密度，將使細(xì)胞簇過(guò)大，而且培養(yǎng)皿內(nèi)過(guò)分擁擠， 影響存活和生長(zhǎng)。但如果培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)目過(guò)少時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)分化較差，因?yàn)樯窠?jīng)細(xì)胞是一種細(xì)胞群體, 它們相互之間具有營(yíng)養(yǎng)和支持作用。其次是控制非神經(jīng)元細(xì)胞過(guò)多增殖。,3 抗DNA 藥物加入培養(yǎng)液 抑制膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)渡增殖,

29、,原代分散單層培養(yǎng)是神經(jīng)細(xì)胞與非神經(jīng)細(xì)胞的混合培養(yǎng)。其中膠質(zhì)細(xì)胞等可在體外繼續(xù)增殖，神經(jīng)元?jiǎng)t不能增殖而只能生長(zhǎng)分化。適量膠質(zhì)細(xì)胞的存在是神經(jīng)細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)的必要條件， 如果神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)渡增殖時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)分化便受到一定影響，常使神經(jīng)細(xì)胞提早開(kāi)始退化。,,,由于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞頻繁分裂過(guò)程中， 奪取了神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)中需要的某種營(yíng)養(yǎng)成份。為保證神經(jīng)元生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)， 需在非神經(jīng)細(xì)胞增殖的高峰即所謂“合流” 時(shí)，將一定量的抗DNA 藥物加入培養(yǎng)

30、液中以抑制其過(guò)渡增殖，實(shí)驗(yàn)證明，在培養(yǎng)第5d 或第7d時(shí)用 5-氟-2-脫氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml或阿糖胞苷3μg/ml，作用48h即停用可加快神經(jīng)元的分化， 延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。,4 培養(yǎng)液必須保持一定的等滲性,,所配制的培養(yǎng)液必須保持一定的等滲性，溶解于培養(yǎng)基的物質(zhì)濃度所產(chǎn)生的等滲性必須與細(xì)胞外液的液體一致，培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞可將培養(yǎng)液的滲透壓調(diào)節(jié)到320-330 mOso 較為合適。如果培養(yǎng)液是高滲的，細(xì)胞會(huì)失去水份并發(fā)生皺縮

31、，如果培養(yǎng)液是低滲的，細(xì)胞會(huì)吸收水分而膨脹。兩者不利于神經(jīng)細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)。,5 掌握換液的次數(shù)和數(shù)量,,為了使神經(jīng)細(xì)胞得到生長(zhǎng)分化必須的營(yíng)養(yǎng)，必須經(jīng)常進(jìn)行換液，但如果換液次數(shù)太多，并不利于神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)分化，因?yàn)樯窠?jīng)細(xì)胞在培養(yǎng)液中需要適當(dāng)?shù)沫h(huán)境，而且它本身也有創(chuàng)造良好環(huán)境的能力，如果頻繁換液就會(huì)破環(huán)這種環(huán)境。一般每周換液二次，每次只換一半，保留一半原液。除此之外，培養(yǎng)液的PH、溫度等均對(duì)神經(jīng)元的生長(zhǎng)發(fā)育有影響，因而在實(shí)驗(yàn)中必須加以注意