人胚胎干細(xì)胞結(jié)合絲素材料向神經(jīng)細(xì)胞分化的實驗研究.pdf

1、人胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cell，hES）是一種取自人囊胚內(nèi)細(xì)胞團，經(jīng)體外分離、培養(yǎng)獲得的一種多能干細(xì)胞。它具有體外無限增殖和多向分化潛能兩個基本特點。生物支架材料是種子細(xì)胞在形成組織之前賴以生存和依附的三維支架，為細(xì)胞的增殖、分化、營養(yǎng)交換、新陳代謝以及細(xì)胞外基質(zhì)分泌等生理活動提供空間場所。用于組織工程的多孔支架材料必需具備良好的生物相容性。因此，以人胚胎干細(xì)胞為種子細(xì)胞、絲素蛋白為支架的復(fù)合體在組織工

2、程研究領(lǐng)域具有廣闊的前景。 本文探討了人胚胎干細(xì)胞系—HUES-17細(xì)胞結(jié)合絲素材料向神經(jīng)細(xì)胞分化的可行性和生物相容性。實驗首先探討了人胚胎干細(xì)胞與絲素材料結(jié)合的可行性及生物相容性。我們將HUES-17細(xì)胞培養(yǎng)于絲素材料培養(yǎng)體系上，通過觀察比較、克隆形成率分析、群體倍增時間分析、堿性磷酸酶檢測、免疫熒光染色、體外分化等方法研究了絲素材料對人胚胎干細(xì)胞的黏附、生長情況、未分化狀態(tài)的維持、胚胎干細(xì)胞特性、分化等方面的影響。結(jié)果顯示：

3、（1） HUES-17細(xì)胞能在絲素材料上形成典型的克隆，邊界清晰．核質(zhì)比較高；（2）克隆形成率（0．2967±0．0272％）和群體倍增時間（47．25±1．40 hrs），與常規(guī)培養(yǎng)體系無顯著差別；（3）胚胎干細(xì)胞未分化檢測指標(biāo)堿性磷酸酶和Oct-4檢測為陽性；（4）體外能分化成多種類型的細(xì)胞。以上實驗證實了人胚胎干細(xì)胞能在絲素材料上生長并維持其未分化狀態(tài)，并且經(jīng)誘導(dǎo)后能在絲素材料上自發(fā)分化成多種類型的細(xì)胞，表明絲素材料與人胚胎干細(xì)胞

4、具有良好的生物相容性，為人胚胎干細(xì)胞應(yīng)用于組織器官的修復(fù)和移植治療時作為支架材料提供實驗依據(jù)。 在保證了絲素材料與人胚胎干細(xì)胞具有生物相容性的前提下，實驗將HUES-17細(xì)胞結(jié)合絲素材料向神經(jīng)細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化，研究人胚胎干細(xì)胞來源的神經(jīng)細(xì)胞與絲素材料的生物相容性。實驗選用目前較為成熟的誘導(dǎo)方案：將HUES-17細(xì)胞懸浮培養(yǎng)7d的EBs接種于明膠包被的培養(yǎng)皿，用N2培養(yǎng)基培養(yǎng)，10-14 d以后，用機械法將呈灶狀生長的細(xì)胞團分離出

5、來，再用N2培養(yǎng)基培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)10 d，得到神經(jīng)球樣細(xì)胞團，將此細(xì)胞團吹打成單細(xì)胞后接種至絲素材料上再進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)。采用上述方法，我們得到大量純凈的nestin陽性細(xì)胞，即神經(jīng)前體細(xì)胞。在神經(jīng)誘導(dǎo)液的誘導(dǎo)下神經(jīng)前體細(xì)胞在絲素材料上進(jìn)一步成熟分化為β—Ⅲ—tubulin陽性的神經(jīng)元。我們將nestin陽性的神經(jīng)球吹打成單細(xì)胞后接種于多聚賴氨酸（polylysine，PLL）和絲素材料上，比較了人胚胎干細(xì)胞來源的神經(jīng)前體細(xì)胞在絲素材料