干擾素膜蛋白(IFITM) Tet-on系統(tǒng)穩(wěn)定細(xì)胞系的建立及其抗CA16病毒的初步研究.pdf

1、背景:手足口病是一種常見的兒童傳染性疾病,該病以手、足和口腔粘膜皰疹或破潰后形成潰瘍?yōu)橹饕R床癥狀,可引起少數(shù)患兒產(chǎn)生心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等并發(fā)癥,病情發(fā)展過快嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致患兒死亡,目前仍然沒有有效的預(yù)防措施及治療手段。IFITM是一種干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗病毒蛋白,其對(duì)多種病毒均具有很好的抑制作用。因此,研究其對(duì)手足口病主要病毒CA16的抗病毒作用可為今后的預(yù)防及治療提供理論依據(jù)。
　　方法:通過Tet-on調(diào)控系統(tǒng),構(gòu)建

2、了受強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)表達(dá) ifitm1/2/3基因的HeLa細(xì)胞系,并初步探索了其對(duì)柯薩奇病毒A16(CA16)的抑制作用。首先將調(diào)控質(zhì)粒pTet-on轉(zhuǎn)染進(jìn)入HeLa細(xì)胞,通過G418篩選出陽(yáng)性克隆細(xì)胞系,在此細(xì)胞系基礎(chǔ)上共同轉(zhuǎn)染反應(yīng)質(zhì)粒pTRE2-IFITM1/2/3和伴侶質(zhì)粒pTK-Hyg,通過潮霉素篩選出單克隆細(xì)胞系,加入強(qiáng)力霉素后Western Blotting篩選出可誘導(dǎo)表達(dá)IFITM1/2/3蛋白的單克隆細(xì)胞系。使用實(shí)時(shí)熒光定

3、量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)表達(dá)的IFITM蛋白對(duì)不同感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)的CA16的抑制作用。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建了受強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)表達(dá)的IFITM細(xì)胞系,細(xì)胞感染不同MOI CA16病毒,Realtime PCR結(jié)果顯示IFITM蛋白對(duì)CA16病毒具有很好的抑制作用,其中IFITM3的抑制效果最為明顯。
　　結(jié)論:Tet調(diào)控ifitm1/2/3基因表達(dá)HeLa