漢灘病毒感染HaCaT細(xì)胞誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生及其分子機(jī)制的初步研究.pdf

1、漢坦病毒(Hantavirus)是布尼亞病毒科(Bunyaviridae)漢坦病毒屬(Hantaviruses)家族成員,其基因組由大(L)、中(M)和小(S)三條單股負(fù)鏈RNA組成。L片段編碼RNA依賴(lài)的RNA聚合酶(Pol),S片段編碼病毒核衣殼蛋白(neucleocapsidprotein,NP),M片段編碼病毒的糖蛋白前體。漢坦病毒屬的漢灘病毒(Hantaanvirus,HTNV)、漢城病毒(Seoulvirus,SEOV)、普

2、馬拉病毒(Puumalavirus,PUUV)等感染引起的腎綜合征出血熱(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)主要流行于亞洲和歐洲國(guó)家;安第斯病毒(Andesvirus,ANDV)、紐約病毒(NewYorkvirus,NYV)和辛諾柏病毒(SinNombrevirus,SNV)等引起的漢坦病毒肺綜合征(hantavirus pulmonary syndrome,HPS)主要流行于美洲國(guó)家

3、,兩者均屬于病死率較高和病情較為嚴(yán)重的急性傳染病。我國(guó)是HFRS的流行大國(guó),發(fā)病人數(shù)居全球首位。其臨床特征主要以發(fā)熱、出血、低血壓休克和急性腎臟功能損傷為主。
　　HFRS的發(fā)病機(jī)制及病理過(guò)程較為復(fù)雜。目前研究認(rèn)為病毒一方面可直接感染臟器組織致使結(jié)構(gòu)和功能異常,另一方面病毒感染機(jī)體激活機(jī)體的固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答,致使機(jī)體內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化,釋放炎癥介質(zhì)、血管活性因子和多種細(xì)胞因子,而最終導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)環(huán)境紊亂和器官功能失調(diào)。

4、>　　漢坦病毒的主要存儲(chǔ)宿主是嚙齒類(lèi)動(dòng)物。其傳播途徑多樣,一般認(rèn)為是人通過(guò)接觸帶毒嚙齒類(lèi)動(dòng)物的排泄物與分泌物經(jīng)傷口、氣溶膠、飲食而感染,其中被帶毒嚙齒類(lèi)動(dòng)物輕微咬傷也可導(dǎo)致感染,而關(guān)于咬傷引起病毒感染的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)及發(fā)生的詳細(xì)分子事件尚不清楚。皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocyte,KC)是人表皮組織的主要組成細(xì)胞,也被認(rèn)為是具有重要功能的非專(zhuān)業(yè)性抗原呈遞細(xì)胞(antigenpresentingcell,APC),可分泌眾多細(xì)胞因子如

5、干擾素、白細(xì)胞介素(IL-1α、IL-1β、IL-3、IL-7、IL-8、IL-10、IL-l8等)、集落刺激因子(G-CSF、GM-CSF)、腫瘤壞死因子、生長(zhǎng)因子、趨化因子等來(lái)抑制外來(lái)病原體的感染,也可通過(guò)表達(dá)MHCⅡ類(lèi)抗原、吞噬加工抗原等參與抗原遞呈而發(fā)揮免疫防御作用。我們推測(cè)在經(jīng)帶毒嚙齒類(lèi)動(dòng)物咬傷而感染漢坦病毒這一過(guò)程中,病毒有可能感染人KC細(xì)胞并誘導(dǎo)機(jī)體的固有免疫應(yīng)答與炎癥反應(yīng),為控制病毒感染或病毒的進(jìn)一步擴(kuò)散提供可能。為此,

6、本研究以永生化的人角質(zhì)形成細(xì)胞系(HaCaT細(xì)胞,具有正常角質(zhì)形成細(xì)胞的全部特性)為研究模型,觀(guān)察HTNV是否感染KC細(xì)胞,以及感染KC細(xì)胞之后能否激活Ⅰ型干擾素固有免疫應(yīng)答以應(yīng)對(duì)病毒感染,并進(jìn)一步探討Ⅰ型干擾素應(yīng)答中存在的可能機(jī)制,為闡明漢坦病毒感染致病過(guò)程中KC細(xì)胞可能作為一種潛在的靶細(xì)胞及發(fā)生的分子事件提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　主要實(shí)驗(yàn)方法和研究結(jié)果：
　　1.HTNV可感染HaCaT細(xì)胞,并能夠在其中復(fù)制增殖
　　用

7、MOI=1的HTNV感染HaCaT細(xì)胞,6h和24h時(shí)分別收集細(xì)胞,在對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行蛋白定量后,以核蛋白(nucleocapsidprotein,NP)的單抗為一抗,采用Westernblot檢測(cè)其中病毒的NP。結(jié)果顯示,病毒感染組在6h和24h均檢測(cè)到特異條帶,與NP的預(yù)期大小一致,而且24h的條帶明顯較強(qiáng),未加病毒感染的對(duì)照組6h和24h均未檢測(cè)到相應(yīng)的特異條帶。以NP的單抗為一抗,用免疫熒光法檢測(cè)病毒感染72h時(shí)細(xì)胞內(nèi)病毒的NP

8、,結(jié)果顯示,在胞漿中觀(guān)察到較強(qiáng)的特異性綠色熒光,即NP有特異的表達(dá);未加病毒對(duì)照組中,胞漿內(nèi)沒(méi)有觀(guān)察到特異的綠色熒光顆粒。以上結(jié)果表明,HTNV可感染HaCaT細(xì)胞,并能夠在其中復(fù)制增殖。
　　2.HTNV感染HaCaT細(xì)胞后可誘導(dǎo)表達(dá)IFNβ
　　用MOI=1的HTNV感染HaCaT細(xì)胞后,于1d和3d分別收集細(xì)胞,qRT-PCR分別檢測(cè)Ⅰ型干擾素IFNα和IFNβ的mRNA。結(jié)果顯示,與未感染對(duì)照組相比,病毒感染后細(xì)胞內(nèi)

9、IFNβmRNA水平在1d和3d時(shí)均顯著升高,而IFNαmRNA水平在1d和3d時(shí)變化均不明顯。結(jié)果表明,HTNV感染HaCaT細(xì)胞誘導(dǎo)了Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生,且以IFNβ為主。
　　3.HTNV感染HaCaT細(xì)胞可激活I(lǐng)FNβ啟動(dòng)子
　　用Lipofectamine2000介導(dǎo)pRL-TK和含IFNβ啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒IF△116共轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞,于6h后進(jìn)行HTNV感染,24h后檢測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果顯示,重組質(zhì)粒IF△1

10、16轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞后經(jīng)HTNV感染,與未感染的細(xì)胞組相比熒光素酶活性明顯增強(qiáng)。該結(jié)果提示,HTNV感染后能明顯激活I(lǐng)FNβ啟動(dòng)子。
　　4.HTNV感染HaCaT細(xì)胞可激活Ⅰ型干擾素應(yīng)答通路中相關(guān)效應(yīng)分子
　　用MOI=1的HTNV感染HaCaT細(xì)胞2h后繼續(xù)培養(yǎng),于不同時(shí)間點(diǎn)分別收集細(xì)胞,并提取細(xì)胞RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,qRT-PCR分別檢測(cè)了Ⅰ型干擾素應(yīng)答通路中關(guān)鍵分子的表達(dá)水平。
　　模式識(shí)別受體(PRR)檢測(cè)

11、結(jié)果顯示,與未感染對(duì)照組相比,病毒感染細(xì)胞組RIG-Ⅰ的mRNA水平在1d和3d時(shí)均顯著升高;MDA5的mRNA水平在1d時(shí)變化不明顯,在3d時(shí)mRNA水平顯著升高;而病毒感染細(xì)胞TLR3的mRNA水平在1d和3d時(shí)均無(wú)明顯升高。該結(jié)果表明,在HTNV激活的干擾素應(yīng)答通路中,RIG-Ⅰ可能在病毒感染初期參與了HTNV的識(shí)別過(guò)程并進(jìn)一步激活了下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路;隨后RIG-Ⅰ和MDA5在介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)應(yīng)答過(guò)程中共同發(fā)揮了重要作用;TLR3可

12、能不參與HTNV感染HaCaT細(xì)胞的識(shí)別過(guò)程。
　　轉(zhuǎn)錄因子IRF3和IRF7檢測(cè)結(jié)果顯示,與病毒未感染對(duì)照組相比,病毒感染細(xì)胞組IRF3和IRF7的mRNA水平在1d時(shí)變化均不明顯,3d時(shí)二者的mRNA水平均明顯升高,其中IRF7的mRNA水平上調(diào)更為顯著;在病毒感染HaCaT細(xì)胞4h、6h和24h時(shí),免疫熒光法檢測(cè)IRF3、IRF7和NF-κB/p65入核情況,結(jié)果顯示在感染6h時(shí),細(xì)胞核內(nèi)能觀(guān)察到明顯的IRF3綠色熒光,而I

13、RF3在4h和24h時(shí),IRF7和NF-κB/p65在4h、6h和24h時(shí)均未觀(guān)察到細(xì)胞核內(nèi)有綠色熒光;隨后的雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)對(duì)NF-κB結(jié)合區(qū)激活情況檢測(cè)結(jié)果顯示,HTNV感染后,NF-κB信號(hào)沒(méi)有被明顯激活。以上結(jié)果提示,在病毒感染初期,活化的IRF3而非NF-κB可能首先入核介導(dǎo)了早期IFNβ基因的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控,IRF7則可能在隨后Ⅰ型干擾素基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮主要作用。
　　轉(zhuǎn)錄因子STAT1和IRF9檢測(cè)結(jié)果顯示,與

14、未感染對(duì)照組相比,病毒感染細(xì)胞組STAT1及IRF9的mRNA水平在1d時(shí)升高均不明顯,在3d時(shí)二者的mRNA水平均明顯升高;病毒感染HaCaT細(xì)胞4h、6h和24h時(shí)免疫熒光法檢測(cè)STAT1入核情況時(shí),結(jié)果顯示在感染細(xì)胞24h時(shí)核內(nèi)能觀(guān)察到明顯的綠色熒光,而4h和6h時(shí)未觀(guān)察到核內(nèi)有綠色熒光;隨后用用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)對(duì)STAT1結(jié)合區(qū)激活情況進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,HTNV感染后,STAT1信號(hào)被明顯激活。以上結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了在干擾

15、素誘導(dǎo)生成的下游通路中磷酸化的STAT1和其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成異三聚體后入核而啟動(dòng)眾多ISG基因的轉(zhuǎn)錄和合成。
　　干擾素刺激因子(ISG)檢測(cè)結(jié)果顯示,與未感染對(duì)照組相比,病毒感染細(xì)胞組MxA、OAS1和IFIT1的mRNA水平在1d、3d和5d時(shí)均顯著升高;IFIT3的mRNA水平在1d時(shí)升高不明顯,在3d和5d時(shí)也明顯升高。MxA和OAS1的mRNA水平呈先上升后下降趨勢(shì);IFIT1和IFIT3的表達(dá)呈持續(xù)上升趨勢(shì)。結(jié)果表明

16、,HTNV感染的HaCaT細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的MxA和OAS1可能在感染早期發(fā)揮主要的抗病毒作用;IFIT1和IFIT3可能在病毒感染后期發(fā)揮重要的抗病毒作用。
　　5.HTNV感染HaCaT細(xì)胞可誘導(dǎo)表達(dá)趨化因子CCL5和CXCL10
　　用MOI=1的HTNV感染HaCaT細(xì)胞,同時(shí)設(shè)病毒未感染對(duì)照組,于1d、3d和5d時(shí)分別收集細(xì)胞,qRT-PCR檢測(cè)CCL5和CXCL10的mRNA水平。結(jié)果顯示,HTNV感染后CCL5和C

17、XCL10均被大量誘導(dǎo)表達(dá),且CXCL10在1d時(shí)表達(dá)較為顯著。結(jié)果提示,CCL5在其受體的介導(dǎo)下可能主要參與病程后期的病毒清除及炎癥反應(yīng),而CXCL10可能在感染初期即參與了機(jī)體強(qiáng)烈的抗病毒反應(yīng)。
　　結(jié)論：
　　綜上所述,HTNV能夠感染人角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT細(xì)胞,感染細(xì)胞后誘導(dǎo)了IFNβ的產(chǎn)生,IFNβ又可引起細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的ISG發(fā)揮抗病毒作用,與此同時(shí)HTNV感染HaCaT細(xì)胞還可產(chǎn)生趨化因子,趨化因子可能參與了