PRRSV感染抑制Ⅰ型和Ⅲ型干擾素及激活NF-κB的分子機(jī)制研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種以妊娠母豬嚴(yán)重繁殖障礙以及仔豬的呼吸道癥狀和高死亡率為特征的新發(fā)病毒性傳染病。自1987年首次在美國(guó)報(bào)道以來(lái),PRRS已遍及世界各主要養(yǎng)豬國(guó)家與地區(qū),并成為危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的傳染病之一,給各國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　 PRRSV感染后,僅能誘導(dǎo)低水平、遲緩的中和抗體,而且病毒在機(jī)體內(nèi)持續(xù)感染導(dǎo)致病毒血癥的長(zhǎng)期存在。人們推測(cè)微弱的天然免疫反應(yīng)

2、是導(dǎo)致這些現(xiàn)象的根本原因,但其具體分子機(jī)制不清楚。為了揭示PRRSV逃避天然免疫的機(jī)制,本文對(duì)PRRSV感染細(xì)胞后的天然免疫反應(yīng)信號(hào)通路進(jìn)行了研究。具體內(nèi)容如下:
　　 1.PRRSV感染抑制IFN-β產(chǎn)生分子機(jī)制的研究
　　 采用IFN-β熒光素酶報(bào)道系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PRRSV感染MARC-145細(xì)胞后不能誘導(dǎo)IFN-β的產(chǎn)生,半定量RT-PCR檢測(cè)也獲得了相似的結(jié)果,而且PRRSV感染能顯著抑制轉(zhuǎn)染雙鏈RNA(poly(

3、IC))誘導(dǎo)激活的IFN-β產(chǎn)生,提示PRRSV可能通過(guò)干擾IFN-β產(chǎn)生的策略進(jìn)行免疫逃避。進(jìn)一步檢測(cè)了PRRSV感染后NF-kB、AP-1和IRF3的激活情況以及IRF3轉(zhuǎn)定位,發(fā)現(xiàn)PRRSV感染細(xì)胞后能激活NF-kB和AP-1,但抑制IRF3的核轉(zhuǎn)位和激活。隨后,針對(duì)干擾素信號(hào)途徑TLR和RIG-Ⅰ進(jìn)行了深入分析,發(fā)現(xiàn)PRRSV感染細(xì)胞后能降低TLR3接頭蛋白TRIF超表達(dá)誘導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生,表明PRRSV可通過(guò)干擾TLR3途徑

4、抑制干擾素的產(chǎn)生。另外,在對(duì)RIG-Ⅰ信號(hào)途徑的分析中,通過(guò)IRF3、TBK1、IKKε、IPS-1、RIG-Ⅰ的超表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)PRRSV感染不干擾TBK1和IKKε下游通路的完整性,但損害IPS-1和RIG-Ⅰ的功能,而且此途徑對(duì)IFN-β產(chǎn)生的抑制作用明顯強(qiáng)于TLR3途徑,表明PRRSV可通過(guò)干擾TLR3和RIG-Ⅰ兩種信號(hào)通路抑制IFN-β的產(chǎn)生,但主要依賴于干擾RIG—Ⅰ途徑。
　　 2.PRRSV感染激活NT-κB的

5、分子機(jī)制的研究
　　 PRRSV感染后抑制IFN-β的產(chǎn)生,但能顯著激活NF-κB。NF-κB是一類具有多重轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的核蛋白因子,不僅在天然免疫反應(yīng)、獲得性免疫反應(yīng)和細(xì)胞的增殖中都有著重要的作用,而且與病毒感染后的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。為了闡明PRRSV感染激活NF-κB的信號(hào)通路,分別研究了RIG-Ⅰ和TLR信號(hào)通路在PRRSV激活NF-kB的作用。結(jié)果顯示PRRSV可通過(guò)TLR信號(hào)通路中的接頭分子TRIF、MyD88和TRA

6、F6激活NF-κB,而與RIG-Ⅰ信號(hào)通路及TRAF2無(wú)關(guān)。為了進(jìn)一步挖掘參與NF-κB激活的PRRSV自身編碼蛋白,通過(guò)NF-κB DNA結(jié)合試驗(yàn)和NF-κB熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)對(duì)PRRSV編碼的所有結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)蛋白N蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp2能夠顯著誘導(dǎo)NF-κB的激活?？紤]到N蛋白在PRRSV中的高度保守性,進(jìn)一步構(gòu)建了N蛋白不同區(qū)域缺失的11種突變體,通過(guò)NF-κB熒光素酶報(bào)道系統(tǒng)分析,發(fā)現(xiàn)N蛋白的30-73

7、位氨基酸是激活NF-κB必需的,而該區(qū)域正好位于N蛋白的RNA結(jié)合域和核定位區(qū)域,提示N蛋白的RNA結(jié)合域和核定位區(qū)域可能在激活NF-κB以及隨后的親炎癥因子的產(chǎn)生中具有重要作用。
　　 3.PRRSV感染抑制IFN-λ1產(chǎn)生分子機(jī)制的研究
　　 IFN-λ是最近才發(fā)現(xiàn)的一類新的Ⅲ型干擾素。為了探討PRRSV感染后IFN-λ的表達(dá)及其可能的作用機(jī)制,通過(guò)熒光定量RT-PCR分析了PRRSV感染細(xì)胞后不同時(shí)間IFN-λ1

8、mRNA的表達(dá),發(fā)現(xiàn)PRRSV感染不能誘導(dǎo)IFN-λ1的產(chǎn)生,提示抑制IFN-λ的產(chǎn)生是PRRSV的另一種有效的免疫逃避策略。通過(guò)IFN-λ1啟動(dòng)子順式作用元件的分析,發(fā)現(xiàn)PRRSV感染抑制dsRNA誘導(dǎo)的IFN-λ1的產(chǎn)生主要通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子IRF的活性。進(jìn)一步通過(guò)IFN-λ1啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)道系統(tǒng)并結(jié)合參與干擾素誘導(dǎo)的各種信號(hào)分子,發(fā)現(xiàn)PRRSV感染不干擾IRF3、TBK1和IKKε下游通路的完整性,但干擾RIG-Ⅰ的接頭分子IPS

9、-1的活性,從而抑制RIG-Ⅰ誘導(dǎo)的IFN-λ1的產(chǎn)生。與PRRSV感染抑制IFN-β產(chǎn)生的信號(hào)通路不同的是,PRRSV感染對(duì)TLR3的接頭分子TRIF誘導(dǎo)的IFN-λ1的產(chǎn)生卻沒(méi)有明顯的影響,提示PRRSV感染主要通過(guò)干擾RIG-Ⅰ信號(hào)通路抑制IFN-λ1的產(chǎn)生。
　　 4.不同類型干擾素抑制PRRSV增殖的比較研究
　　 PRRSV對(duì)干擾素的高度敏感性提示干擾素可以作為抗PRRSV感染的一種潛在的治療性制劑。迄今為止

10、,已有Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型干擾素被發(fā)現(xiàn)。為了比較不同類型干擾素抗PRRSV的效果和可能的作用機(jī)制,分別測(cè)定了IFN-α2、IFN—β、IFN-γ、IFN-λ1(IL-29)和IFN-λ2(IL-28a)對(duì)PRRSV增殖的影響。結(jié)果表明,所有的干擾素對(duì)PRRSV的增殖都有抑制效果且呈劑量依賴性,但是Ⅰ型和Ⅲ型干擾素抑制PRRSV的增殖的效果明顯強(qiáng)于Ⅱ型干擾素。任何兩種干擾素的聯(lián)合作用都沒(méi)有顯著地提高它們的抗PRRSV效果。此外,IFN-α2、