小鼠骨髓DC 2-DE技術(shù)體系建立及其蛋白質(zhì)表達分析.pdf

1、樹突狀細胞是機體中功能最強的專職抗原遞呈細胞，既能直接激活初始型T淋巴細胞，啟動早期特異性免疫應(yīng)答；又能誘導(dǎo)免疫耐受，具有強大的激活CTL及CD4+Th細胞的能力，控制著體內(nèi)免疫反應(yīng)的過程，在免疫應(yīng)答中處于中心位置，已成為免疫學(xué)及相關(guān)學(xué)科的研究熱點。 髓系樹突狀細胞分化發(fā)育的各階段具有不同的功能特點。未成熟期樹突狀細胞可由粘附分子選擇素介導(dǎo)進入炎癥組織，并具有極強的抗原內(nèi)吞和加工處理能力，但其激活初始T細胞的能力較弱。利用DC來

2、增強機體特異性抗腫瘤免疫能力的研究，已成為腫瘤生物治療的重要課題。同時，國內(nèi)外都已將其作為腫瘤疫苗應(yīng)用于基因治療，取得了很好的臨床效果。如果將抗原引入未成熟樹突狀細胞，使之發(fā)育為成熟細胞，則在臨床應(yīng)用上更為理想。 仙臺病毒載體是細胞質(zhì)型RNA載體，對各種動物細胞有較高的感染效率；在理論上不存在改變細胞核內(nèi)染色體的危險性，與以往的載體相比具有更高的安全性。仙臺病毒載體作為基因治療、基因疫苗、基因(蛋白質(zhì))功能分析及蛋白質(zhì)生產(chǎn)研究的

3、載體，受到許多學(xué)者的青睞。 本課題對小鼠骨髓來源的未成熟樹突狀細胞的蛋白質(zhì)表達進行了分析，通過雙向電泳和MALDI-TOFMS分析，運用MS-Fit工具進行鑒定；對仙臺病毒載體處理的成熟DC進行比較蛋白質(zhì)組分析，尋找差異蛋白；對DC所表達的蛋白質(zhì)在細胞中的生理作用以及它們相互間的作用進行了分析和探討。研究結(jié)果如下： 1.以樹突狀細胞、成纖維細胞、黑色素瘤細胞、宮頸癌CasKi細胞、昆蟲細胞Bm5和e21為研究材料，在不同

4、條件下進行2-DE，采用改進的銀染法檢測蛋白斑點，所分離得到的蛋白點能夠滿足進行質(zhì)譜分析的要求。 2.未成熟DC表達的蛋白質(zhì)用2-DE進行分離，得到了約660個蛋白點，取其中118個蛋白點進行MALDI-TOFMS分析，獲得了87個蛋白點的PMF圖，經(jīng)鑒定、分析發(fā)現(xiàn)，其中與未成熟DC免疫調(diào)節(jié)功能相關(guān)的蛋白質(zhì)有40個，占45.98％；與大分子代謝相關(guān)的有37個，占42.53％。 3.感染SeV后的DC表達蛋白經(jīng)質(zhì)譜分析為胞

5、苷脫氫酶、肌動蛋白素、谷胱甘肽S一轉(zhuǎn)移酶、甲硫氨酸-tRNA甲酰轉(zhuǎn)移酶、ADP／ATP轉(zhuǎn)位酶 2、凋亡效應(yīng)子Caspase-4前體、肌動蛋白、蛋白酶體p42亞基、腺苷酸環(huán)化酶相關(guān)蛋白2、磷酸葡萄變位酶3、IL-1受體、熱休克蛋白70．2、葡萄糖調(diào)控蛋白前體、70kDa熱休克蛋白8、乙酸輔酶A連接酶2。 4.感染SeV-sfltl和Sev／AF后DC與未成熟DC相比較，未表達的蛋白質(zhì)經(jīng)質(zhì)譜分析為半胱氨酸蛋白酶抑制劑F的前體

6、、前折疊素的亞基2、膠質(zhì)成熟因子γ、肽脯氨酰順反異構(gòu)酶(環(huán)孢素A結(jié)合蛋白)、鋅指蛋白9。其它蛋白質(zhì)只是在表達量上有所下調(diào)。 5.SeV、SeV／AF、SeV-sfltl分別感染未成熟DC，在感染后1、2、3、5、7天，檢測DC增殖、凋亡、表面標志物的表達情況。結(jié)果顯示，SeV、SeV／AF、SeV-sfltl感染后對DC的增殖、凋亡及細胞表面標志物表達的影響沒有統(tǒng)計學(xué)差異。 6.對未成熟DC表達的轉(zhuǎn)錄因子和凋亡因子的生物

7、功能進行了探討。鋅指蛋白是細胞中重要的轉(zhuǎn)錄因子，在轉(zhuǎn)錄水平上對蛋白的表達進行調(diào)控。凋亡因子Bcl-2和caspase在細胞的凋亡過程中發(fā)揮重要作用。熱休克蛋白在蛋白質(zhì)的折疊、定位以及細胞應(yīng)激反應(yīng)中有著重要作用。 7.仙臺病毒載體對DC蛋白表達的影響表現(xiàn)在兩個方面：蛋白質(zhì)種類的的減少和表達量的下調(diào)。前者主要是因為病毒的復(fù)制序列所造成的，后者主要由載體攜帶的目的基因引起。仙臺病毒載體進入DC后，RNA大量復(fù)制，結(jié)構(gòu)蛋白合成增加，導(dǎo)致

8、DC細胞質(zhì)中蛋白質(zhì)合成減少。去除復(fù)制序列后，病毒RNA不能進行復(fù)制，只能依靠轉(zhuǎn)入DC的RNA作為模板進行轉(zhuǎn)錄和翻譯，因此DC的蛋白表達下調(diào)。 總之，本課題建立了適宜各種細胞蛋白質(zhì)表達分析的技術(shù)體系，特別是在蛋白質(zhì)的分離過程中，用銀染法檢測2-DE后凝膠上的蛋白斑點，這就可以減少樣品用量，對不易獲得的材料也能開展蛋白質(zhì)組研究。未成熟DC的蛋白質(zhì)表達分析得到了87個蛋白點，這對于深入理解DC在免疫系統(tǒng)中的作用具有重要意義。仙臺病毒載