腎透明細(xì)胞癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)的CD99選擇性剪接異構(gòu)體的初步探討.pdf

1、目的:尋找人腎透明細(xì)胞癌(ccRCC)中發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)CD99的選擇性剪接異構(gòu)體，探討CD99選擇性剪接異構(gòu)體表達(dá)與ccRCC轉(zhuǎn)移的關(guān)系，并探討其選擇性剪接異構(gòu)體表達(dá)與ccRCC間的關(guān)系。 方法:前期采用cDNA基因表達(dá)譜芯片研究本實(shí)驗(yàn)室建立的漢族人能夠無(wú)限傳代的2株在動(dòng)物模型中證實(shí)具有轉(zhuǎn)移潛能的RCC細(xì)胞系(RCC05-TXJ、RCC05-ZYJ)基因表達(dá)譜，從中選取CD99為興趣基因。通過(guò)選擇性剪接數(shù)據(jù)庫(kù)(Alternati

2、ve Splicing Database，ASD)對(duì)基因CD99可能存在的選擇性剪接異構(gòu)體進(jìn)行預(yù)測(cè)。針對(duì)預(yù)測(cè)的結(jié)果，使用PrimerPremier5.0及Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)6種預(yù)測(cè)異構(gòu)體的RT-PCR引物，采用半定量RT-PCR檢測(cè)在轉(zhuǎn)移組織、發(fā)生及未發(fā)生轉(zhuǎn)移的原發(fā)癌組織、癌旁組織的各混合樣本中檢測(cè)預(yù)測(cè)異構(gòu)體的表達(dá)情況。ccRCC轉(zhuǎn)移和原發(fā)腫瘤標(biāo)本來(lái)源于2004年1月-2007年9月長(zhǎng)海、長(zhǎng)征醫(yī)院泌尿外科腎癌根治術(shù)的患者以及長(zhǎng)征醫(yī)

3、院骨科轉(zhuǎn)移癌切除標(biāo)本，其中包括9例已發(fā)生轉(zhuǎn)移的ccRCC原位組織和及其相應(yīng)轉(zhuǎn)移組織，轉(zhuǎn)移包括骨轉(zhuǎn)移2例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移2例及癌栓5例；21例未發(fā)生轉(zhuǎn)移的ccRCC原位組織和及其相應(yīng)癌旁組織。男性18例，女性12例，平均年齡為52.04歲，最小年齡為40歲，最大為77歲，經(jīng)病理證實(shí)，均為腎透明細(xì)胞癌。將PCR產(chǎn)物凝膠回收，與pMD18-T載體連接，經(jīng)α篩選后轉(zhuǎn)染DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌液送測(cè)序，應(yīng)用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行序列的比對(duì)分析。經(jīng)驗(yàn)證從組織中擴(kuò)

4、增的產(chǎn)物與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果一致，確認(rèn)為新的選擇性剪接異構(gòu)體后，使用同樣的引物應(yīng)用半定量RT-PCR在30例原發(fā)腫瘤(包括9例已發(fā)生轉(zhuǎn)移的原發(fā)癌組織及21例未發(fā)生轉(zhuǎn)移的癌組織)、21例癌旁組織及9例轉(zhuǎn)移組織樣本中檢測(cè)CD99Ⅰ、CD99Ⅱ和新型CD99選擇性剪接異構(gòu)體(CD99Ⅲ)的表達(dá)水平。 結(jié)果:從6種預(yù)測(cè)異構(gòu)體中篩選出一種新型異構(gòu)體(CD99Ⅲ)。該異構(gòu)體在轉(zhuǎn)移組織中表達(dá)(8/9)高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的原發(fā)癌組織(10/21)(