痤瘡丙酸桿菌活菌誘導單核細胞系THP—1細胞因子表達及反應氮中間產(chǎn)物系統(tǒng)殺傷作用的研究.pdf

1、本實驗選用來源于人急性單核細胞性白血病的單核細胞系THP-1，研究單核細胞在被P.acnes活菌刺激后的早期天然免疫階段，趨化性細胞因子IL-8，調(diào)節(jié)性細胞因子IL-10、IL-12，促炎細胞因子TNF-α和RNI系統(tǒng)中誘導型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase，iNOS)、NO及自然抗性相關巨噬細胞蛋白1(naturalresistanceassociated-macrophageprotein1，N

2、ramp1)表達量的變化，探討天然免疫系統(tǒng)中單核-巨噬細胞細胞因子表達及反應氮中間產(chǎn)物(reactivenitrogenintermediate，RNI)系統(tǒng)殺傷作用的時相變化規(guī)律。 第一部分：痤瘡丙酸桿菌活菌誘導THP-1細胞IL-8、IL-10、IL-12、TNF-α的表達。 通過使用實時熒光定量PCR△Ct定量法，觀察P.acnes活菌刺激人源性單核細胞系THP-1后不同時段細胞因子IL-8、IL-10、IL-12

3、、TNF-α的表達水平，探討P.acnes活菌誘導THP-1表達細胞因子的時相規(guī)律。結果顯示： 1.P.acnes活菌刺激后6hIL-8即達到高峰(P＜0.05)，到24h開始降低，72h后仍維持較高水平，說明與其他細菌感染一樣，IL-8趨化大量中性粒細胞，參與天然免疫系統(tǒng)針對P.acnes感染的早期免疫應答，這與早期痤瘡病理學特點中大量中性粒細胞聚集的表現(xiàn)相符合。 2.IL-10、IL-12表達量均在刺激后24-48h

4、達到高峰(P＜0.05)，72h后開始逐漸下降，提示在IL-12升高的同時，作為對炎癥反應的負調(diào)控，IL-10也開始表達，而且二者表達量變化的趨勢一致，從而調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡和NK、LAK細胞活性，在誘導炎癥反應殺傷P.acnes的同時減少對機體的損傷。 3.TNF-α在刺激后6h到達高峰(P＜0.05)，48h后明顯降低，提示單核細胞在P.acnes感染早期表達TNF-α，促進T細胞、B細胞的增殖，活化單核-巨噬細胞，提高

5、中性粒細胞的吞噬能力，介導炎癥反應。 上述結果說明，在針對P.acnes感染的天然免疫早期應答階段，單核細胞即通過Toll樣受體(TLRs)等模式識別受體識別P.acnes，表達IL-8、IL-12、TNF-α，進一步刺激單核-巨噬細胞、中性粒細胞、NK、LAK、CTL等免疫細胞分化增殖和相關促炎癥細胞因子的表達，并且誘導、調(diào)節(jié)適應性免疫應答。這些細胞因子的表達，一方面殺傷P.acnes，另一方面也引起皮損局部血管擴張、血管通透

6、性增加、各種炎癥細胞聚集，從而產(chǎn)生炎癥反應，皮損表現(xiàn)為紅腫、丘疹及膿皰。同時，IL-10也開始對炎癥反應進行負調(diào)控，控制炎癥反應的程度，避免過度炎癥反應造成的損傷。提示IL-8、IL-12p40、TNF-α是P.acnes感染后肉芽腫性病理表現(xiàn)形成的重要因素之一。 第二部分：痤瘡丙酸桿菌活菌誘導THP-1細胞iNOS、NO及Nrampl的表達。 通過使用實時熒光定量PCR△Ct定量法，觀察P.acnes活菌刺激人源性單核

7、細胞系THP-1后不同時段iNOS、Nrampl的表達水平，通過Griess比色法檢測培養(yǎng)液上清中NO的含量，探討P.acnes活菌誘導THP-1產(chǎn)生活性氮中間產(chǎn)物相關因子的時相規(guī)律。結果顯示： 1.iNOS表達量在刺激后6h即顯著增加(P＜0.01)，維持到48小時開始降低，而NO濃度在刺激后6h即顯著升高(P＜0.01)，到72h時仍維持較高水平，說明在P.acnes感染早期，單核—巨噬細胞系統(tǒng)就能作出反應，同時iNOSmR

8、NA表達的高峰時段要比細胞培養(yǎng)液中NO含量高峰出現(xiàn)得早，而上清中NO濃度可在較高水平保持到72h，可能是因為iNOS的生物學活性可以維持96至120h，NO在培養(yǎng)液中積累所致。 2.Nrampl表達量在刺激后6h開始顯著增加(P＜0.01)，維持到48h開始降低，說明Nrampl作為二價陽離子泵，在P.acnes感染瞬時免疫應答階段即參與天然免疫過程，對RNI反應系統(tǒng)發(fā)揮輔助作用上述結果說明，天然免疫中的RNI反應系統(tǒng)在P.ac

9、nes感染的初期即參加免疫反應，Nrampl在RNI系統(tǒng)啟動的同時也開始參與早期的天然免疫反應，可能意味著該系統(tǒng)可以抑制P.acnes產(chǎn)生抵抗NO殺傷的酶。 綜上所述，在本實驗中，應用實時熒光定量PCR△Ct定量法、Griess比色法，發(fā)現(xiàn)在P.acnes活菌刺激后，人源性單核細胞系THP-1在早期免疫應答階段細胞因子IL-8、IL-10、IL-12、TNF-α和RNI系統(tǒng)中iNOS、NO及Nrampl蛋白表達量顯著增加。說明細

10、胞因子IL-8、IL-10、IL-12、TNF-α在單核-巨噬細胞系統(tǒng)的表達高峰主要在早期免疫應答階段，96h后主要是由適應性免疫系統(tǒng)細胞產(chǎn)生，提示P.acnes能夠通過這些細胞因子引起肉芽腫樣改變。在針對P.acnes感染的早期免疫應答階段，單核-巨噬細胞的RNI系統(tǒng)可以一直保持較高的非特異殺傷作用，為了抑制細菌產(chǎn)生抗RNI的酶類，二價陽離子通道蛋白Nrampl也同時表達，從而在由天然免疫到適應性免疫的過渡過程中，保持對細菌的殺傷抑制