結(jié)核分枝桿菌eis基因表達對人THP-1細胞細胞因子分泌的影響.pdf

1、目的：結(jié)核菌的持留性和結(jié)核分枝桿菌的耐藥性為目前控制結(jié)核病的兩大難題，結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)的持留性，結(jié)核持留菌的存在是結(jié)核病感染呈現(xiàn)慢性化的最主要原因。結(jié)核持留菌在機體內(nèi)的存在是臨床上診斷和治療結(jié)核病時結(jié)核菌的潛伏感染、結(jié)核病復(fù)發(fā)、結(jié)核菌耐藥、遷延不愈，結(jié)核病治療期限延長、預(yù)后不佳等一系列問題發(fā)生的原因，持留菌通過多種渠道和方式從抗結(jié)核藥物的滅菌和機體的免疫系統(tǒng)殺傷中逃逸出來，保持

2、了結(jié)核分枝桿菌在環(huán)境中的穩(wěn)定性和對機體內(nèi)環(huán)境的適應(yīng)性和無反應(yīng)性，導(dǎo)致耐藥和持留。至今結(jié)核分枝桿菌的持留的機制尚未完全明確，持留的途徑尚未完全揭開，因此臨床上迄今為止并沒有針對結(jié)核持留菌進行完全有效治療的方法，并進一步控制結(jié)核病。而研究發(fā)現(xiàn)MTB能進入巨噬細胞，且被巨噬細胞吞噬后，由于巨噬細胞內(nèi)特殊基因的表達，導(dǎo)致了結(jié)核菌對巨噬細胞胞內(nèi)環(huán)境的適應(yīng)，從而達到持留作用。結(jié)核分枝桿菌基因組者全序列的闡明基礎(chǔ)研究中為臨床上根除持留菌從基因和分子生

3、物學(xué)的角度為揭開結(jié)核桿菌持留生存的機制提供了理論支持。MTBeis基因僅存在于致病性MTB中，可抑制細胞保護性免疫反應(yīng)，增加非致病性MTB在宿主細胞內(nèi)的持留，eis基因產(chǎn)物Eis蛋白為一可溶性分泌蛋白，分子量大致為42kd，能作用于巨噬細胞，有研究證實該42kd蛋白能夠影響巨噬細胞腫瘤壞死因子（tunlornecrosisfactor，TNF）-a和白介素（interlukin，IL)-10的分泌，有效的抑制了單核巨噬細胞細胞的活化而與

4、持留的的關(guān)聯(lián)。本課題組之前何師姐的實驗結(jié)果已經(jīng)證實結(jié)核分枝桿菌eis基因的產(chǎn)物Eis蛋白能夠提升巨噬細胞吞噬恥垢分枝桿菌之后恥垢桿菌于宿主巨噬細胞內(nèi)的生存率，結(jié)核分枝桿菌在單核巨噬細胞內(nèi)的比較具體的持留機制尚不清楚。目前已有文獻指出，機體細胞因子表達和分泌的變化對機體的免疫和結(jié)核分枝桿菌在巨噬細胞的持留和潛伏感染都會產(chǎn)生影響，eis基因可增加結(jié)核菌在巨噬細胞的持留是否與其可能影響吞噬細胞細胞因子的分泌和作用有關(guān)，目前文獻中報到的很少。<

5、br>　　IL-10具有非常廣泛的生物學(xué)的活性，其為一種多功能的機體負性免疫調(diào)節(jié)的細胞因子，是一種免疫抑制性的細胞因子，且有高效性。能改變機體免疫應(yīng)答和MHCⅡ類抗原表達，也可選擇性抑制巨噬細胞某些方面的功能，也抑制了對T細胞和B細胞的功能。本次實驗的主要目的即使為了要探索eis基因?qū)Y(jié)核分枝桿菌感染單核巨噬細胞之后的巨噬細胞分泌和表達的各種細胞因子影響，篩選出具有差異性表達的細胞因子，為進一步從細胞免疫入手研究eis基因持留機制提供實

6、驗依據(jù)。
　　方法：
　　1.以RPMI1640培養(yǎng)基（內(nèi)含10％胎牛血清）培養(yǎng)濃度為1×105的Thp-1細胞，之后PMA誘導(dǎo)細胞使Thp-1細胞分化，將重組結(jié)核分枝桿菌MS-pmv261-eis及對照菌MS-pmv261培養(yǎng)7天后離心集菌，少量培養(yǎng)基用力吹打、震蕩混合均勻，紫外光分光光度計計算細菌濃度，最后按MOI=10：1感染Thp-1細胞分化的巨噬細胞。
　　2.取細胞上清液，用ELISA方法檢測eis基因?qū)

7、HP-1細胞中IL-10的影響將THP-1細胞種至6孔板，以PMA誘導(dǎo)分化24小時后以PBS清洗細胞并以重組分枝桿菌感染細胞，18h收集細胞上清液，室溫下1000g離心15min，取100hul以ELISA檢測IL-4,IL-6,IL-10,IL-12,INF-γ表達情況；根據(jù)標準品濃度和測得的OD值繪制成為標準曲線，根據(jù)描繪的標準曲線計算出各實驗組細胞因子的濃度。
　　3.收集細胞提取細胞總RNA，RT-PCR檢測試劑盒進一步檢

8、測IL-10的濃度，在基因?qū)用娴谋磉_。18h后收集細胞，提取總RNA，根據(jù)上述ELISA檢查結(jié)果設(shè)計特異性表達IL-10細胞因子的引物，RT-PCR檢測進一步確證該細胞因子的基因表達。引物序列：上游引物:5’-GGCTTCCTAACTGCTACA-3’下游引物:5’-CTCCTGACCTCAAGTGAT-3；反應(yīng)條件:PCR反應(yīng)條件為：95o C預(yù)變性5 min；95 oC變性30s，60 oC退火30s，72oC延伸30s,共35個循

9、環(huán)后再72oC延伸10min。PCR擴增結(jié)束，PCR擴增的產(chǎn)物進行收集，后進行1%瓊脂糖凝膠電泳。
　　4.用統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)， SPSS15.0統(tǒng)計軟件，以x±s表示，兩組進行t檢驗。
　　結(jié)果：
　　1.PMA成功誘導(dǎo)THP-1細胞轉(zhuǎn)化為巨噬細胞，重組結(jié)核分枝桿菌MS-pmv261-eis及對照菌MS-pmv261，按MOI=10：1感染Thp-1細胞分化的巨噬細胞。
　　2.ELISA結(jié)果顯示，結(jié)核分枝桿菌e

10、is基因可引起IL-10 OD值明顯增加（P<0.05），而對細胞因子IL-4、IL-6、IL-12、INF-γ的表達無顯著影響（P＞0.05）
　　3.收集細胞后提取的巨噬細胞細胞RNA，之后進行的RT-PCR的檢測，測定的結(jié)果為IL-10的mRNA條帶的表達增強。
　　結(jié)論：
　　1.提取細胞培養(yǎng)的細胞上清液，檢測eis基因?qū)奘杉毎置谝约氨磉_和IL-10等細胞因子的影響，以 ELISA方法。結(jié)果表明eis基因能