Cpn0810基因克隆與表達(dá)及誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞產(chǎn)生前炎癥細(xì)胞因子和凋亡的研究.pdf

1、目的：構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX6p-2/Cpn0810，在E.coli BL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，純化獲得重組融合蛋白Cpn0810。研究該重組蛋白在體外誘導(dǎo)人單核細(xì)胞產(chǎn)生前炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的水平及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，為進(jìn)一步探索Cpn感染致病的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：PCR擴(kuò)增Cpn0810蛋白編碼基因，構(gòu)建pGEX6p-2/Cpn0810重組質(zhì)粒，測(cè)序正確后在E.coli BL21中誘導(dǎo)表達(dá)，用SDS-PA

2、GE和Western-Blot進(jìn)行分析和鑒定。用ToxinEraser純化柱去除內(nèi)毒素后用不同濃度的GST-Cpn0810刺激THP-1細(xì)胞；ELISA法檢測(cè)經(jīng)刺激后的THP-1細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α和IL-6水平；以 WST-1法檢測(cè)經(jīng) GST-Cpn0810處理后對(duì) THP-1細(xì)胞的增生或抑制作用；用Hoechst33258熒光染色、AnnexinV-FITC-PI染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果：構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEX6p-

3、2/Cpn0810，并在E.coli BL21菌中高效表達(dá)出Mr約為42kDa的GST-Cpn0810目的蛋白，超聲裂解后SDS-PAGE分析目的蛋白在菌體細(xì)胞內(nèi)以可溶性形式表達(dá)，經(jīng)采用默克Novagen的GST純化樹脂純化獲得純度在95％以上的重組蛋白。GST-Cpn0810能誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)TNF-α和IL-6，并以時(shí)間、劑量依賴方式刺激細(xì)胞分泌前炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-6，當(dāng) GST- Cpn0810的濃度為4μg/m

4、L時(shí)產(chǎn)生的TNF-α和IL-6量最多，分別為（184.75±17.40）pg/mL、（75.36±29.49）pg/mL；當(dāng) GST-Cpn0810刺激 THP-1細(xì)胞24h時(shí)產(chǎn)生的TNF-α和IL-6量則達(dá)到高峰。另外GST-Cpn0810以劑量依賴方式抑制THP-1細(xì)胞增殖。當(dāng)10μg/mL GST-Cpn處理THP-1細(xì)胞24h后，形態(tài)學(xué)上，細(xì)胞表現(xiàn)為皺縮、核碎裂、細(xì)胞起泡及凋亡小體等凋亡特征。
　　結(jié)論：
　　1.成