多西環(huán)素誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡及治療大鼠角膜堿燒傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、多西環(huán)素是一種半合成的四環(huán)素類(lèi)抗生素，具有多方面的抗炎作用。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)多西環(huán)素可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞、人體細(xì)胞凋亡，其中有參與機(jī)體免疫反應(yīng)的細(xì)胞，我們推測(cè)誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞凋亡可能是多西環(huán)素一個(gè)新的抗炎機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)以單核細(xì)胞系THP-1為細(xì)胞模型，探討多西環(huán)素誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制，為多西環(huán)素抗炎作用提供理論依據(jù)。 角膜堿燒傷是嚴(yán)重的創(chuàng)傷性眼病，其病理過(guò)程復(fù)雜，病情嚴(yán)重，治療棘手，預(yù)后差，對(duì)人民健康和家庭社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成嚴(yán)重影

2、響。炎癥和新生血管是影響角膜堿燒傷愈后的兩個(gè)重要病理過(guò)程。多西環(huán)素具有多方面的抗炎作用。近期研究表明多西環(huán)素對(duì)角膜新生血管也有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)以大鼠角膜堿燒傷為模型，研究多西環(huán)素眼液對(duì)角膜堿燒傷炎癥過(guò)程及新生血管形成的影響，探討多西環(huán)素治療角膜堿燒傷的機(jī)制。 第1章多西環(huán)素誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究。 目的：研究多西環(huán)素誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡的作用。 方法：以PMA誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化貼壁，分別按5 mg

3、/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、80mg/L的濃度梯度加入多西環(huán)素，作用12 h或48 h，設(shè)空白對(duì)照組。觀察細(xì)胞形態(tài)變化，采用MTT法檢測(cè)THP-1細(xì)胞活性，AnnexinV和PI雙染色后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)THP-l細(xì)胞早期凋亡，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)檢測(cè)THP-1細(xì)胞晚期凋亡。 結(jié)果：隨著多西環(huán)素濃度增高，THP-1細(xì)胞收縮變圓，細(xì)胞間距增寬乃至完全分離，死亡、崩解

4、的THP-1細(xì)胞逐漸增多。MTT法顯示隨著多西環(huán)素作用濃度增高，活性THP-1細(xì)胞數(shù)量逐漸下降。流式細(xì)胞儀檢測(cè)和TUNEL檢測(cè)顯示THP-1細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡率均伴隨多西環(huán)素作用濃度的升高而升高。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)首次闡明多西環(huán)素可以誘導(dǎo)人THP-1細(xì)胞凋亡，其效應(yīng)呈明顯的劑量依賴(lài)關(guān)系。 第2章多西環(huán)素誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究。 目的：探討多西環(huán)素誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。 方法：以PM

5、A誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化貼壁，按濃度梯度加入多西環(huán)素，設(shè)空白對(duì)照組，按實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹谱骷?xì)胞爬片或收集細(xì)胞。采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)THP-1細(xì)胞的FasL表達(dá)情況。采用PI染色檢測(cè)THP-1細(xì)胞周期。Western blot檢測(cè)THP-1細(xì)胞核NF-κB含量。 結(jié)果：多西環(huán)素各個(gè)濃度處理組未發(fā)現(xiàn)THP-1細(xì)胞FasL表達(dá)增加。各個(gè)多西環(huán)素處理組和對(duì)照組的G1期、G2期及S期細(xì)胞百分率兩兩比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。多西環(huán)素能抑制NF-κB

6、轉(zhuǎn)移至核內(nèi)發(fā)生生物學(xué)效應(yīng)，其效應(yīng)呈劑量依賴(lài)關(guān)系。 結(jié)論：多西環(huán)素可能通過(guò)抑制NF-κB活性誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡。 第3章多西環(huán)素抑制堿燒傷大鼠角膜的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。 目的：研究多西環(huán)素抑制堿燒傷大鼠角膜炎癥反應(yīng)的作用及分子機(jī)制。 方法：制作大鼠角膜堿燒傷模型，設(shè)對(duì)照組、地塞米松組和多西環(huán)素組，分別點(diǎn)眼液溶媒、0.1﹪地塞米松眼液和0.5﹪多西環(huán)素眼液，于堿燒傷后第3、7、14、21天隨機(jī)取4只大鼠，誘導(dǎo)麻

7、醉后裂隙燈觀察照相，計(jì)算炎癥指數(shù)。隨后處死，角膜取材，一半角膜10﹪福爾馬林固定行病理組織切片，HE染色，進(jìn)行炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)，另一半-80℃保存，備ELISA檢測(cè)。角膜組織病理切片行原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)檢測(cè)。 結(jié)果：各時(shí)間點(diǎn)多西環(huán)素組炎癥指數(shù)低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多西環(huán)素抑制炎癥作用與地塞米松組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。各時(shí)間點(diǎn)多西環(huán)素組炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多西

8、環(huán)素抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的作用與地塞米松組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。各時(shí)間點(diǎn)多西環(huán)素組角膜ICAM-1濃度低于對(duì)照組，除第7天p值為0.072外，其余各組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。地塞米松抑制ICAM-1表達(dá)的作用強(qiáng)于多西環(huán)素。角膜組織原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)檢測(cè)顯示，對(duì)照組偶有炎癥細(xì)胞凋亡，地塞米松組無(wú)炎癥細(xì)胞凋亡，多西環(huán)素組有明顯增多的炎癥細(xì)胞凋亡。 結(jié)論：多西環(huán)素可能通過(guò)降低ICAM-1的表達(dá)及誘導(dǎo)

9、炎癥細(xì)胞凋亡抑制堿燒傷大鼠角膜的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。 第4章多西環(huán)素抑制堿燒傷大鼠角膜的新生血管形成。 目的：研究多西環(huán)素抑制堿燒傷大鼠角膜新生血管形成的作用及可能機(jī)制。 方法：臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定，加入梯度濃度的多西環(huán)素，觀察多西環(huán)素對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性的影響。制作大鼠角膜堿燒傷模型，設(shè)對(duì)照組、地塞米松組和多西環(huán)素組，分別點(diǎn)眼液溶媒、0.1﹪地塞米松眼液和0.5﹪多西環(huán)素眼液，于堿燒傷后第3、7、14、

10、21天隨機(jī)取4只大鼠，誘導(dǎo)麻醉后裂隙燈觀察照相，計(jì)算炎癥指數(shù)及新生血管面積。隨后處死，角膜取材，一半角膜10﹪福爾馬林固定行病理組織切片，HE染色，進(jìn)行炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)，另一半-80℃保存，備ELISA檢測(cè)。 結(jié)果：臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)CD31和CD34。在多西環(huán)素作用下，臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性受到抑制，呈劑量依賴(lài)關(guān)系。各時(shí)間點(diǎn)多西環(huán)素組炎癥指數(shù)低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多西環(huán)素抑制炎癥作用與地塞米松組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。各時(shí)

11、間點(diǎn)多西環(huán)素組炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多西環(huán)素抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的作用與地塞米松組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。地塞米松組和多西環(huán)素組的各時(shí)間點(diǎn)新生血管面積均小于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。地塞米松組第3、7天新生血管面積小于多西環(huán)素組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組的新生血管面積與炎癥指數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系。多西環(huán)素組各時(shí)間點(diǎn)角膜VEGF表達(dá)低于對(duì)照組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。地塞米松組第3、7天角膜VEGF表達(dá)低于對(duì)照組，第14、21天表達(dá)高于