肺炎嗜衣原體Cpn0425重組蛋白的克隆表達(dá)及誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞產(chǎn)生前炎癥細(xì)胞因子和凋亡的研究.pdf

1、目的:構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX6p-2/Cpn0425,在E.coli BL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),純化獲得重組融合蛋白Cpn0425。研究該重組蛋白在體外誘導(dǎo)人單核細(xì)胞產(chǎn)生前炎癥細(xì)胞因子 IL-8和IL-1β的水平及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用,為進(jìn)一步探索 Cpn感染致病的分子機(jī)制提供試驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:PCR擴(kuò)增肺炎嗜衣原體 Cpn0425蛋白編碼基因,構(gòu)建pGEX6p-2/Cpn0425重組質(zhì)粒,測序正確后在 E.coli BL21中誘導(dǎo)

2、表達(dá),用SDS-PAGE和Western-Blot進(jìn)行分析和鑒定。用谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GST)瓊脂糖凝膠FF純化重組蛋白,A280紫外分光光度法測定純化蛋白濃度,用鱟試驗(yàn)法檢測純化后蛋白的內(nèi)毒素。用ToxinEraser純化柱去除內(nèi)毒素后用不同濃度的GST-Cpn0425刺激THP-1細(xì)胞;ELISA法檢測經(jīng)刺激后的THP-1細(xì)胞產(chǎn)生的IL-8和IL-1β水平;以WST-1法檢測經(jīng)G

3、ST-Cpn0425處理后THP-1細(xì)胞的增生或抑制作用;用Hoechst33258熒光染色、DNA片段化分析、AnnexinV-FITC-PI染色法檢測細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果:構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEX6p-2/Cpn0425,并在E.coli BL21菌中高效表達(dá)出Mr約為50kDa的GST-Cpn0425目的蛋白,超聲裂解后SDS-PAGE分析目的蛋白在菌體細(xì)胞內(nèi)以可溶性形式表達(dá),經(jīng)采用默克Novagen的GST純化樹脂純化獲

4、得純度在95％以上的重組蛋白。GST-Cpn0425能誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)IL-8和IL-1β,并以時(shí)間、劑量依賴方式刺激細(xì)胞分泌前炎癥細(xì)胞因子IL-8和IL-1β,當(dāng) GST-Cpn0425的濃度為6μg/mL時(shí)產(chǎn)生的IL-8量最多,為(716.11±41.26)pg/mL當(dāng)GST-Cpn0425的濃度為8μg/mL時(shí)產(chǎn)生的IL-1β量最多,為(32.91±5.49)pg/mL;當(dāng)GST-Cpn0425刺激THP-1細(xì)胞24h時(shí)產(chǎn)生

5、的IL-8和IL-1β量則達(dá)到高峰。另外GST-Cpn0425以劑量依賴方式抑制THP-1細(xì)胞增殖;當(dāng)12μg/mL GST-Cpn處理THP-1細(xì)胞48h后,形態(tài)學(xué)上,細(xì)胞表現(xiàn)為皺縮、核碎裂、細(xì)胞起泡及凋亡小體等凋亡特征。
　　結(jié)論:
　　1.成功克隆Cpn0425基因并構(gòu)建了pGEX6p-2/Cpn0425原核表達(dá)載體,將其轉(zhuǎn)化至E.coli BL21后能高效表達(dá)出一相對分子質(zhì)量約50kDa的GST-Cpn0425融合蛋