鉑類聯(lián)合抗嘧啶類藥物序貫療法在宮頸癌治療中的實驗研究.pdf

1、化學(xué)治療已經(jīng)成為宮頸癌的綜合治療的方法之一。Meta分析[1]結(jié)果表明：與手術(shù)后放療比，化療后再手術(shù)治療是宮頸癌有效的治療模式，5年生存率提高7％~14％?？灌奏ゎ愃幬锸歉鞣N進展期癌癥治療中的重要化療藥物[2]。國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)2003年推薦宮頸癌使用順鉑(75mg/m2)加氟尿嘧啶(4000mg/m2，靜脈滴注>96h)為宮頸癌患者的化療方案。美國國家癌癥研究所推薦此方案為宮頸鱗癌的標準治療方案。該方案中順鉑的毒副作用限制了

2、它的應(yīng)用，5-FU也存在生物利用度低、應(yīng)用不方便等缺點。有必要尋找新的療效確實、毒副反應(yīng)較小、用藥方便的化療藥物和化療方案。 卡鉑作為第二代鉑類藥物，劑量限制性的毒副作用顯著減少，可以根據(jù)患者腎功能個體化用藥，卡培他濱是口服的5-FU前體藥物，具有選擇性的細胞毒作用，能夠模擬持續(xù)輸注5-FU的作用。胸苷磷酸化酶(thymidinephosphorylase，TP)不僅是卡培他濱選擇性發(fā)揮細胞毒作用的關(guān)鍵酶，還能催化5-FU向其活

3、性代謝產(chǎn)物氟尿嘧啶脫氧核苷酸轉(zhuǎn)化，提高患者對抗嘧啶類藥物的敏感性。應(yīng)用抗嘧啶類藥物時，胸苷磷酸化酶(thymidinephosphorylase，TP)高的患者術(shù)后平均生存時間長。TP的表達可決定腫瘤對抗嘧啶類藥物的化療敏感性，是卡培他濱(capecitabine，CAP)化療的預(yù)后預(yù)測標記物[3]。 本課題組已有研究表明卡鉑與DFUR(卡培他濱的水化制劑)聯(lián)合的細胞抑制作用比順鉑與DFUR聯(lián)合強，但均弱于順鉑聯(lián)合5-FU。順鉑

4、和卡鉑對宮頸癌SiHa細胞株的TP表達均有上調(diào)作用，但是SiHa細胞在鉑類藥物作用后TP上調(diào)怎樣變化?TP升高后再加用抗嘧啶類藥物，是否會取得更好的化療效果?可否利用TP的變化尋找更好療效的序貫化療方案?這些問題值得進一步探討。 本研究通過體外培養(yǎng)宮頸癌SiHa細胞株，研究順鉑、卡鉑上調(diào)TP的變化情況、比較二者的異同：并利用這個變化研究聯(lián)合5-FU、OFUR序貫化療方案對宮頸癌細胞株抑制作用的影響，期望尋找療效確切、用藥方便、毒

5、性較低的宮頸癌輔助化療方案。 研究方法： 1.細胞培養(yǎng)和藥物處理 SiHa細胞株應(yīng)用RPMI1640培養(yǎng)基，置于含5％CO2、37℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗分組為：對照組、順鉑組、卡鉑組共3組。根據(jù)本課題組已有結(jié)論選擇藥物作用72小時的IC50，順鉑和卡鉑分別是：19uM，236.82uM；DMSO的濃度控制在0.5％。 2.RT-PCR檢測順鉑和卡鉑對宮頸癌細胞株TPmRNA表達的影響 各組細胞

6、分別于藥物作用后0，4，8，12，16，24，36，48小時檢測TPmRNA表達。 3.Westernblot檢測順鉑和卡鉑對宮頸癌細胞株TP蛋白表達的影響 各組細胞分別于藥物作用后0，6，12，18，24，30小時檢測TP蛋白表達。 4.MTT法檢測順鉑和卡鉑上調(diào)TP后5-Fu、DFUR序貫用藥細胞的增殖抑制情況 分9組：空白對照組，順鉑+5-FU對照組(DF組，同時加藥組)、順鉑+5-FU實驗組(DF

7、’組，先加順鉑，TP峰值時加5-FU，即序貫方案組)，卡鉑+5-Fu對照組(CF組)、卡鉑+5-FU實驗組(CF’組)，順鉑+DFUR對照組(DD組)、順鉑+DFUR實驗組(DD’組)，卡鉑+DFUR對照組(CD組)、卡鉑+DFUR實驗組(CD’組)。 順鉑、卡鉑均選用藥物作用72小時的IC50，5-FU，DFUR參考臨床最大峰值血藥濃度各選取八個實驗濃度。 以5×103個細胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板，24h后，除空白對照

8、組外，其他對照組同時加入鉑類和抗嘧啶類藥物(根據(jù)上述分組加5-Fu或者DFUR八個遞減濃度組)，實驗組只加入相應(yīng)鉑類藥物，培養(yǎng)24小時后，全部棄舊培養(yǎng)基，實驗組加入含相應(yīng)遞減濃度的抗嘧啶類藥物，余組別加入不含藥物之新鮮培養(yǎng)基，再次培養(yǎng)24小時之后，MTT法在酶標儀上測定OD595。 5.流式細胞儀檢測藥物對宮頸癌細胞株凋亡的影響(FITC/PI雙標記試劑盒) 分9組，同4。藥物濃度選擇：5-FU、DFUR、順鉑、卡鉑均選

9、用藥物作用72小時的IC50。DMSO濃度控制在0.5％。用6孔板，接種24h后，除空白對照組外，其他對照組同時加入鉑類和抗嘧啶類藥物，實驗組只加入相應(yīng)鉑類藥物，培養(yǎng)24小時后，全部棄舊培養(yǎng)基，實驗組加入含相應(yīng)抗嘧啶類藥物，余組別加入不含藥物之新鮮培養(yǎng)基，再次培養(yǎng)24小時之后收集細胞按FITC/PI雙標記試劑盒說明檢測各組細胞凋亡率。 結(jié)果： 1.順鉑和卡鉑對宮頸癌細胞株TPmRNA及蛋白表達的影響順鉑和卡鉑作用4～8小

10、時后TPmRNA表達開始增加，24小時達高值，相對于空白組，順鉑組升高2.52倍，卡鉑組升高1.90倍，24小時后漸降低，順鉑和卡鉑作用6～12小時后TP蛋白增加，24小時達高峰，順鉑組和卡鉑組表達分別是對照組的3.45倍和2.73倍。蛋白質(zhì)增加幅度大于mRNA，順鉑組與卡鉑組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 2.5-FU、DFUR在與順鉑、卡鉑聯(lián)合用藥時序貫化療對宮頸癌細胞株細胞增殖抑制的影響在TP升高后抗嘧啶類藥物作用24小時MTT檢測

11、結(jié)果：實驗組相對于對照組全部增殖明顯，所有實驗組的IC50全部較對照組升高，相比于聯(lián)合5-FU的組別，聯(lián)合DFUR組別的實驗組和對照組差別較小。 3.5-FU、DFUR在與順鉑、卡鉑聯(lián)合用藥時序貫化療對宮頸癌細胞株凋亡的影響實驗組凋亡率均較相應(yīng)對照組要高，方差分析僅卡鉑+OFUR實驗組與對照組有統(tǒng)計學(xué)意義的；4個實驗組之間比較，聯(lián)合DFUR的組別凋亡率絕對值均高，但均無統(tǒng)計學(xué)意義；聯(lián)合DFUR的實驗組凋亡率高于傳統(tǒng)化療方案對應(yīng)的