腸出血型大腸埃希菌O157-H7 EspF蛋白靶向結合線粒體并誘導細胞凋亡的研究.pdf

1、一、研究背景和目的
　　 腸出血型大腸埃希菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC)O157∶H7是一種食源性人畜共患腸道病原微生物，可引起人和動物嚴重的腹瀉、出血性腸炎(haemorrhagic colitis，HC)、溶血性尿毒綜合癥(Haemolytic uraemic syndrome，HUS)、血栓性血小板減少性紫癜(thrombotic thromobocytopenic p

2、orpura，TTP)等。1983年，Riley等首次報道了發(fā)生在美國的腸出血型大腸埃希菌O157∶H7引起的嚴重食源性疾病—出血性結腸炎。此后，由EHEC O157∶H7引起的散發(fā)病例和小型暴發(fā)在世界范圍內不斷發(fā)生。2000年，據世界衛(wèi)生組織( WHO)報告，在加拿大Ontario市Walkerton區(qū)發(fā)生了一起5000人口的EHEC O157∶H7的暴發(fā)流行，其中27人住院治療，5人死亡，據報道暴發(fā)流行是由Walkerton區(qū)的供水

3、系統(tǒng)受到污染引起的。世界各地，腸出血型大腸埃希菌O157∶H7的暴發(fā)與流行仍時有發(fā)生，發(fā)病呈上升趨勢，由于病情兇險，病死率高(HUS死亡率90％以上)，已引起各國政府及醫(yī)療衛(wèi)生、科研機構的高度重視。
　　 EHEC O157∶H7的致病機制目前尚不十分清楚，其主要致病基因有志賀樣毒素基因( stx)、大毒力質粒pO157和染色體腸細胞脫落位點LEE(the locus ofenterocyte effacement，LEE)致病

4、島等。EHEC O157∶H7感染引起的典型病理特征是腸上皮細胞黏附-抹去（attaching and effacing，A/E）損傷。目前研究認為，引起黏附-抹去（attaching and effacing，A/E）損傷的毒力因子大多位于其LEE致病島，效應蛋白多達20多種，其中效應蛋白EspF的作用范圍最大，是多功能性的。EspF蛋白可以突破腸上皮屏障，定位于宿主細胞的線粒體，啟動線粒體途徑的凋亡，且EspF的N端是線粒體靶向信號

5、(mitochondrial targeting signal，MTS)功能區(qū)，因為將MTS區(qū)缺失突變，EspF蛋白靶向結合于宿主線粒體的功能消失。利用谷氨酸代替EspF的第16位亮氨酸，EspF靶向結合于宿主細胞線粒體的功能完全消失，因此認為MTS的第16位亮氨酸是EspF蛋白重要的功能部位。EspF蛋白遷移到宿主細胞線粒體后，與線粒體靶向結合，啟動細胞線粒體途徑的凋亡:引起線粒體膜通透性改變，進而導致細胞線粒體膜電位降低，細胞色素C

6、從線粒體釋放到細胞漿，引起Caspase家族蛋白酶-9和Caspase家族蛋白酶-3的裂解。感染后期EspF在核仁聚集，并且這一過程受線粒體調控，這種機制的闡明將為細菌蛋白在宿主細胞的時空調控機制揭開新的篇章。近來，一些研究發(fā)現EspF可以通過SH3和EVH1結構域分別與宿主蛋白SNX9(sortingnexin9)和Wiskott- Aldrich綜合征蛋白(Wiskott- Aldrich syndrome protein，WASP

7、)結合，認為EspF集合SNX9和WASP，形成新的信號模仿物，導致上皮細胞緊密連接破壞、微絨毛消失、細胞骨架重排、肌動蛋白聚集、墊狀結構(pedestal)形成，最后引起細胞程序性凋亡，這在A/E損傷中起主要作用。學術界，效應蛋白EspF被認為是病原細菌致病的瑞士軍刀，對于研究EHEC致病的分子機制至關重要。
　　 盡管近些年對EspF有了更深一步的研究，證實EspF可以突破腸上皮屏障，降低宿主細胞的跨膜電阻，破壞腸屏障功能，

8、參與破壞腸上皮細胞緊密連接，但EspF蛋白誘導宿主細胞死亡的機制仍然不是很清楚。那么EHEC O157∶H7的EspF蛋白，是否對細菌的黏附性、在宿主細胞的定位及對線粒體途徑的凋亡都有影響呢？本實驗的前期研究中，我們采用重疊延伸PCR(OL-PCR)和同源重組技術，已成功構建了espF基因缺失突變株EHEC O157∶H7(△espF)，該突變株表達的EspF蛋白N端第15-68個氨基酸殘基缺失，這就為我們進一步研究EspF蛋白的功能奠

9、定了基礎。鑒于目前尚缺乏商品化EHEC O157∶H7 EspF蛋白抗體，本研究從制備EHEC O157∶H7 EspF蛋白多克隆抗體開始，并進行純化和鑒定，進而運用該抗體通過細胞免疫熒光技術證明EHEC O157∶H7 EspF蛋白和宿主細胞線粒體的共同定位趨勢，并用線粒體膜電位檢測試劑盒比較野生株和突變株引起宿主細胞早期凋亡的程度，可望揭示EspF蛋白在EHEC O157∶H7感染導致腸上皮細胞產生黏附-抹去損傷中的分子機制。

10、>　　 二、研究方法
　　 1.腸出血型大腸埃希菌O157∶H7 EspF蛋白多克隆抗體的制備和初步純化
　　 (1)抗原設計與合成應用DNAStar軟件子程序Protean，分別采用Hopp-Woods和Kyte-Doolittle方案預測氨基酸親水性，采用Karplus-Schultz和Emini方案預測柔韌性及表面可能性，采用Jameson-Wolf方案和吳氏抗原指數法預測潛在的B細胞抗原表位。選取B細胞表位的優(yōu)

11、勢區(qū)段，在其C端通過半胱氨酸( Cys)偶聯鑰孔血藍蛋白(KLH)。設計的抗原委托上海吉爾生化有限公司合成。
　　 (2)多克隆抗體的制備和初步純化2只新西蘭白兔（體重1.5～2.5kg，分別編號為1、2），免疫前耳緣靜脈取血2ml，分離血清，-20℃冷凍保存作為對照。免疫時間為第1、28、42、66天，每次用量為1mg/兔?？乖鞍兹苡?ml生理鹽水，初次免疫時與等體積的福氏完全佐劑乳化均勻，家兔背部及肩胛部皮內多點注射（2m

12、l/只），加強免疫時用福氏不完全佐劑乳化均勻，家兔兩肩兩腿部肌肉注射。在第二次加強免疫后，采兔耳緣靜脈血1ml制備血清，ELISA測定抗血清效價，以檢驗是否有抗體產生。最后一次免疫10d后，ELISA測定抗血清效價，心臟取全血約80ml，分離血清，-20℃分裝凍存?zhèn)溆?。通過間接ELISA檢測抗血清效價，Western blot檢測抗血清特異性。并用辛酸-硫酸銨法純化抗血清，SDS-PAGE檢測抗體純度。
　　 2.EHEC分泌的

13、 EspF蛋白在宿主lovo細胞的亞定位共聚焦培養(yǎng)皿接種lovo細胞，至細胞長滿至80％。腸出血型大腸埃希菌O157∶H7(野生株和espF基因缺失突變株(△espF)），190rpm，37℃搖動孵育12h。細菌作用于細胞2h（細胞∶細菌=1:100）（空白對照control未加細菌作用）。PBS洗滌三遍，10min/次。4％多聚甲醛室溫固定30min。0.05％Triton室溫作用20min。PBS洗滌2次，5min次。含1％BSA的

14、PBS室溫封閉1h。稀釋1抗4℃孵育18h。PBS洗滌三次，10min/次。熒光2抗室溫避光孵育45min。PBS洗滌三次，10min/次。DAPI室溫避光孵育3-5min。PBS洗滌2次，5min/次。激光共聚焦顯微鏡拍照、分析。
　　 3.細菌黏附實驗lovo細胞進行載玻片爬片后，細菌感染作用于細胞2h后PBS洗滌，電鏡專用2.5％的戊二醛固定液置4℃固定2h，送電鏡室進一步處理、鏡檢。
　　 4.細胞凋亡線粒體膜電

15、位檢測24孔細胞培養(yǎng)板接種lovo細胞，至細胞長滿至80％。腸出血型大腸埃希菌O157∶H7(野生株和espF基因缺失突變株(△espF)），190rpm，37℃搖動孵育12h。細菌作用于細胞（細胞∶細菌=1:100）分別0.5、1.5、2.5h（空白對照control未加細菌作用）。PBS洗滌三遍，10min/次。按照JC-1試劑盒說明書操作。熒光顯微鏡鏡檢、拍照。
　　 三、結果
　　 1.制備和純化了腸出血型大腸埃

16、希菌O157∶H7 EspF蛋白多克隆抗體間接ELISA法檢測多抗血清效價，第二次加強免疫后測定抗血清效價，1號兔子為1:1024000，2號兔子為1:512000，表明有抗體產生。加強免疫三次后1、2號白兔的抗血清效價均可達1:2048000。Western blot證實免疫前血清和EHECO157∶H7野生株及espF基因缺失突變株的EspF蛋白無反應，免疫后血清對EHEC O157∶H7野生株和espF基因缺失突變株的EspF蛋白

17、均有特異性?？寡褰浶了?硫酸銨法純化后，SDS-PAGE電泳可見分子量為55kD和22kD的2條帶，分別相當于抗體的重鏈和輕鏈，證明抗血清經純化后可獲得一定純度的抗體。
　　 2.EHEC分泌的EspF蛋白靶向結合于宿主細胞的線粒體細胞質內EHECO157∶H7野生株的EspF蛋白綠色熒光信號強，對應部位的線粒體熱休克蛋白70的紅色熒光信號也強，表現出明顯的正相關性，EspF蛋白與線粒體熱休克蛋白70存在明顯的共同定位現象。e

18、spF基因缺失突變株EspF蛋白綠色熒光信號較強，而對應部位的線粒體熱休克蛋白70的紅色熒光信號或強或弱，沒有明顯的相關性，無共同定位趨勢，說明EspF蛋白結合線粒體的能力下降。空白對照組（即未加細菌作用組）未檢測到EspF蛋白的綠色熒光信號。這在沿直線的熒光信號強度掃描比對中得到進一步證實:野生株組沿直線的綠色和紅色的熒光強度曲線走勢是一致的，表現出明顯的正相關性，而espF基因缺失突變株組沿直線的綠色和紅色的熒光強度曲線走勢無相關性

19、。這也說明野生株EspF蛋白靶向結合于宿主細胞的線粒體，而突變株的結合能力下降。
　　 那么，EspF蛋白是否與細胞核結合呢？在細胞核所在部位，EHEC野生株EspF蛋白發(fā)出的綠色熒光信號比較弱，突變株則幾乎觀察不到綠色熒光信號。同樣的沿直線進行細胞核內熒光信號強度掃描發(fā)現:EHEC野生株EspF蛋白的綠色熒光信號強度，與細胞核DNA發(fā)出的藍色熒光信號強度走勢向背，espF基因缺失突變株EspF蛋白的綠色熒光信號強度，與細胞核D

20、NA發(fā)出的藍色熒光信號強度走勢也是向背的，都表現出明顯的負相關性，這表明EHEC野生株和espF基因缺失突變株的EspF蛋白都未在細胞核聚集。
　　 3.細菌黏附實驗EHEC O157∶H7野生株和espF基因缺失突變株作用結腸癌細胞lovo細胞后，培養(yǎng)，固定，處理樣品，電子顯微鏡觀察，EHEC O157∶H7野生株作用于lovo細胞2h，可見細胞膜表面聚集大量的細菌，未見細胞膜有明顯損傷。突變株作用于lovo細胞2h，可見細胞

21、膜上有較少細菌黏附，未見細胞膜有明顯損傷。陰性對照DH5α作用于lovo細胞2h，可見細胞的細胞膜完整整齊，膜上有極少量細菌黏附。
　　 4.細胞凋亡線粒體膜電位檢測熒光顯微鏡下觀察檢測線粒體膜電位變化:正常細胞，為高紅高綠（紅:++，綠:++）。當野生株、突變株與lovo細胞作用0.5h時，EHEC野生株表現出明顯的熒光強度改變，紅色熒光減少，綠色熒光增加;而espF基因缺失突變株還可觀察到明顯的紅色熒光，綠色熒光沒有野生株強

22、，說明細菌與細胞作用0.5h時，線粒體膜電位已經明顯的降低，細胞已開始凋亡，且野生株比espF基因缺失突變株快。在細菌與細胞作用1.5h時，EHEC野生株紅色熒光逐漸減弱，綠色熒光逐漸增強，而espF基因缺失突變株熒光強度的改變進程稍慢。在細菌與細胞作用2.5h時，EHEC野生株紅色熒光基本消失，綠色熒光達到最大強度，而espF基因缺失突變株還可觀察到低強度的紅色熒光，說明細菌與細胞作用2.5h，野生株導致細胞凋亡程度比espF基因缺失

23、突變株強。這表明EHEC野生株對線粒體的毒性作用明顯大于espF基因缺失突變株，espF基因的缺失使EspF蛋白誘導的線粒體途徑凋亡能力減弱。
　　 四、結論
　　 1.成功地制備了效價高、特異性強的EHEC O157∶H7 EspF蛋白多克隆抗體。
　　 2.EHEC O157∶H7的EspF蛋白在細菌感染宿主細胞的過程中定位于宿主細胞的線粒體，且EspF蛋白的N端是線粒體靶向信號(mitochondrial