腸出血型大腸埃希菌O157-H7中VI型分泌系統(tǒng)及其底物的功能和調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、作為一類食源性病原菌，腸出血型大腸埃希菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC）感染宿主后，既可以釋放一些毒素，如志賀毒素，又可以緊密地黏附在宿主的腸粘膜上，并由III型分泌系統(tǒng)（T3SS）的介導(dǎo)，將腸上皮細(xì)胞膜穿孔，損壞微絨毛結(jié)構(gòu)，造成黏附與擦拭（Attaching and Effacing，A/E）損傷。這些過程都可導(dǎo)致嚴(yán)重的感染癥狀，如腹痛、腹瀉，出血性腸炎，進(jìn)而引起溶血性尿毒綜合征甚至死

2、亡。包括T3SS在內(nèi)的多種分泌系統(tǒng)，存在于諸多革蘭陰性病原菌中。這些分泌系統(tǒng)通過在細(xì)菌的膜上組裝出跨膜運(yùn)輸通道，將行使不同功能的特異性底物轉(zhuǎn)運(yùn)出胞外，來完成各種生物學(xué)過程。
　　在革蘭陰性細(xì)菌中普遍存在的Hcp（溶血素共調(diào)節(jié)蛋白）不含信號(hào)肽，卻又被外向分泌。研究表明，作為新型分泌系統(tǒng)，VI型分泌系統(tǒng)（T6SS）負(fù)責(zé)特異性轉(zhuǎn)運(yùn)該蛋白。在如霍亂弧菌等諸多病原菌中，將T6SS或者h(yuǎn)cp敲除，均可導(dǎo)致相應(yīng)的突變株毒力減弱。而銅綠假單胞菌可

3、憑借由T6SS介導(dǎo)的抗細(xì)菌生長能力，在自然環(huán)境中獲得生存優(yōu)勢。作為毒力因子等的分泌通路，T6SS對(duì)于病原菌致病性的作用和意義仍需深入研究。
　　為了從T6SS的角度，更深入地闡明EHEC的致病機(jī)制，我們以O(shè)157:H7型EHEC的參考菌株EDL933為研究對(duì)象，通過相似性比對(duì)，在其基因組上的毒力島（O-island）上發(fā)現(xiàn)了T6SS的典型編碼基因簇，找到了約13個(gè)核心組分的編碼基因。隨后，我們界定出該基因簇的具體范圍，從z0243

4、到z0275，含32個(gè)ORF，全長為36.5 kb。在主要基因簇外還另發(fā)現(xiàn)z0706和z0707分別為hcp和vgrG的同源基因。我們通過構(gòu)建動(dòng)物模型和細(xì)胞模型，結(jié)合細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)，從多方面闡述了T6SS的生物學(xué)特征，并總結(jié)出T6SS與EHEC致病性的關(guān)系，包括：
　　1、利用λRed同源重組法構(gòu)建了ΔT6SS，研究發(fā)現(xiàn)，ΔT6SS在生長速率、遷移能力等的方面相比于野生型（WT）并無明顯不同。隨后，通過LC-MS/MS檢測WT與ΔT6

5、SS的分泌蛋白組分并加以對(duì)比分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，我們鑒定到T6SS新的底物：Z1921。通過詳細(xì)地生理生化檢測，我們發(fā)現(xiàn)，Z1921（以后命名為KatN）為Mn-過氧化氫酶，可分解H2O2，有助于細(xì)菌耐受由H2O2引起的氧化應(yīng)激。無論是否外加終濃度為1 mM的H2O2，在對(duì)數(shù)期，RpoS和OxyR都可正調(diào)控katN的轉(zhuǎn)錄，維持KatN在細(xì)胞內(nèi)的含量。
　　2、通過改變培養(yǎng)條件（如37℃、25℃、pH5.5、pH8.1和2%NaCl等）

6、或更換培養(yǎng)基（如LB、M9CA和DMEM等），都不能將T6SS的活性再提高。然而H-NS可抑制由水平基因轉(zhuǎn)移而獲得的基因的轉(zhuǎn)錄。通過轉(zhuǎn)錄組測序，我們比較了Δhns和WT基因轉(zhuǎn)錄水平的差異，發(fā)現(xiàn)在Δhns中，有954個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)差異，其中78%的基因轉(zhuǎn)錄水平提高，包括T6SS的相關(guān)基因。該結(jié)果得到了定量PCR和Western blotting的證實(shí)。
　　3、在以BALB/c為小鼠模型的感染實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)被ΔT6SS感染后，

7、小鼠的生存水平明顯高于WT組，說明T6SS與EHEC對(duì)小鼠的毒力有關(guān)。相比于WT，在對(duì)數(shù)后期，Δhns的生長開始放緩，到平臺(tái)期時(shí)，細(xì)菌密度也較低，提示其需要更多的資源來使更多基因得以表達(dá)。在Δhns的基礎(chǔ)上，無論是否敲除T6SS編碼基因簇或katN，細(xì)菌對(duì)小鼠的毒力沒有明顯改變。提示Δhns為高毒株。當(dāng)被鼠巨噬細(xì)胞吞噬后，T6SS相關(guān)基因及katN的表達(dá)水平明顯提高，而當(dāng)敲除hns后，這種提高幅度更大。若在此基礎(chǔ)上再敲除T6SS編碼基因

8、簇或katN，則細(xì)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)幾乎無法生長。這提示我們，當(dāng)被鼠巨噬細(xì)胞吞噬后，EHEC通過激活T6SS來維持生存。同時(shí)，在被吞噬后，細(xì)菌的rpoS表達(dá)上調(diào)，說明此時(shí)細(xì)菌面臨的氧化應(yīng)激水平增高。
　　綜上所述，在感染小鼠時(shí)，T6SS與EHEC對(duì)小鼠毒力的發(fā)揮有關(guān)。特別在感染初期，當(dāng)被鼠巨噬細(xì)胞吞噬后，EHEC可通過RpoS感知因“呼吸爆發(fā)”而增強(qiáng)的氧化應(yīng)激（如H2O2濃度升高），提高katN的表達(dá)水平，隨后KatN被T6SS轉(zhuǎn)運(yùn)出