免疫捕獲—實(shí)時(shí)熒光LAMP法快速檢測大腸埃希氏O157-H7的研究.pdf

1、分類號：!S2Q2：壘密級：公玨單位代碼：!QQ晝魚學(xué)號：2Q!Q!壘墨免疫捕獲實(shí)時(shí)熒光LAMP法快速檢測大腸埃希氏O157：H7的研究RapiddetectionofEcoli0157：H7byimmunocaptureandRealTimeFluorescenceLAMP學(xué)位申請人：金婷婷指導(dǎo)教師：袁耀武教授學(xué)科專業(yè)：微生物學(xué)學(xué)位類別：理學(xué)碩士授予單位：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)答辯日期：二。一三年五月三十日摘要腸出血性大腸桿菌0157：H7感染

2、性腹瀉是近年來發(fā)現(xiàn)的危害嚴(yán)重的腸道傳染病。它除引起腹瀉、出血性腸炎外，還可發(fā)生溶血性尿毒綜合征(rrOS)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)等嚴(yán)重的并發(fā)癥，后者病情兇險(xiǎn)，病死率高。目前對病原微生物的檢測主要依靠病原體分離培養(yǎng)法、免疫學(xué)方法和各種PCR方法。然而，以上方法耗時(shí)耗力、敏感性和特異性低、檢測費(fèi)用高，不適用于現(xiàn)場快速檢測和基層普及應(yīng)用。LAMP技術(shù)克服了常規(guī)技術(shù)的缺點(diǎn)，能夠在1h內(nèi)恒溫、特異、高效、快速地?cái)U(kuò)增出109靶序列拷貝的

3、DNA，更適合臨床病原微生物的檢測要求。但在實(shí)際樣品檢測中常常需要進(jìn)行前增菌步驟，增菌時(shí)間一般在18～24h，因此改善樣品處理方法，縮短樣品處理時(shí)間具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究將免疫捕獲技術(shù)與環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)有效結(jié)合，以Ecoli0157：H7菌體作為抗原，首先制備了抗Ecoil0157：H7單克隆抗體及多抗，鑒定純化后進(jìn)行特異性試驗(yàn)，其中單抗具備良好的特異性，而多抗經(jīng)過交叉反應(yīng)菌體吸收后也達(dá)到了同樣效果。將二者作為捕獲抗體

4、，包被于酶標(biāo)板，用來特異性捕獲樣品中的Ecoil0157：H7。其次利用LAMP方法，通過PrimerExplorerV4設(shè)計(jì)LAMP引物，檢測大腸0157菌體表面抗原rfbE基因，并探討其特異性和靈敏度。最后利用已經(jīng)建立的免疫捕獲實(shí)時(shí)熒光LAMP方法，對人工污染Ecoil0157：H7的全脂乳進(jìn)行靈敏度檢測。本研究篩選出一株穩(wěn)定分泌抗Ecoil0157：H7抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為2BAl2；成功制備出抗Ecoil0157：H7的單

5、抗和多抗，兩種抗體經(jīng)辛酸硫酸銨法純化后進(jìn)行質(zhì)量鑒定，單抗的蛋白質(zhì)濃度為15125mg／mL，多抗的蛋白質(zhì)濃度為12463mg／mL。間接ELISA測得單體效價(jià)為1：80000，多抗效價(jià)為1：1：64000。經(jīng)過單抗和多抗捕獲后進(jìn)行的實(shí)時(shí)熒光LAMP反應(yīng)，對Ecoil0157：H7的檢出限分別為25CFU／mL和18CFU／mL，與LAMP方法檢出限水平一致。采用免疫捕獲方法進(jìn)行的樣品前處理時(shí)間一般在25h左右，因此在保證了LAMP方法檢