分泌蛋白EspF在腸出血性大腸埃希菌O157-H7導(dǎo)致宿主黏附-抺去損傷中的作用及其致病機(jī)制研究.pdf

1、一、研究背景和目的：
　　 腸出血性大腸埃希菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157:H7是一種食源性人畜共患腸道病原微生物,可導(dǎo)致食物中毒,引起人和動(dòng)物嚴(yán)重的腹瀉、出血性腸炎(haemorrhagic colitis,HC)、溶血性尿毒綜合癥(Haemolyticuraemic syndrome,HUS)、血栓性血小板減少性紫癜(thromboticthromobocytop

2、enic porpura,TTP)等。1983年,Riley等首次報(bào)道了美國(guó)密執(zhí)安州和俄勒岡州發(fā)生腸出血性大腸埃希菌O157:H7引起的嚴(yán)重食源性疾病一出血性結(jié)腸炎。此后,由EHEC O157:H7引起的散發(fā)病例和小型暴發(fā)在世界范圍內(nèi)不斷發(fā)生。1986年,我國(guó)首次從出血性結(jié)腸炎患者中分離到EHEC O157:H7。目前,已有十余個(gè)省份從市售食品、進(jìn)口食品、家畜家禽、腹瀉患者糞便中分離到該菌。目前,在世界各地,腸出血性大腸埃希菌O157:

3、H7暴發(fā)與流行仍時(shí)有發(fā)生,發(fā)病呈上升趨勢(shì),對(duì)社會(huì)公共衛(wèi)生和人類(lèi)健康構(gòu)成極大威脅。
　　 EHEC O157:H7的毒力因子主要有緊密黏附素(Intimin)、分泌蛋白、志賀毒素Ⅰ型、Ⅱ型(Shiga toxin,StxⅠ、StxⅡ)和溶血素(Haemolysin,Hly)等,腸出血性大腸埃希菌O157:H7的致病作用主要通過(guò)產(chǎn)生志賀樣毒素(STX1和STX2)和細(xì)菌對(duì)腸黏膜上皮細(xì)胞黏附-抹去損傷(attaching and ef

4、facing lesion,A/E損傷)完成。
　　 EHEC O157:H7導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞特異性A/E損傷的相關(guān)致病蛋白主要位于染色體上的腸細(xì)胞脫落位點(diǎn)(Locus of enterocyte effacement,LEE)致病島內(nèi)。LEE毒力島大小35-43kb,由LEE1(ler,escRSTU)、LEE2(escCJ,sepZ,cesD)、LEE3(escVN)、LEE4(espABD、espF)和LEE5(tir,ea

5、e,cesT)等5個(gè)操縱子組成[16],包含41個(gè)開(kāi)放讀碼框,分別編碼外膜黏附素(adhesin)、緊密素(intimin)、Ⅲ型分泌系統(tǒng)(TTSS)、轉(zhuǎn)位蛋白(EspA,EspB,EspD)、效應(yīng)蛋白(Tir,EspG,EspF,Map,EspH)、伴侶分子(CesAB,CesD,CesD2,CesF,CesT)和調(diào)控子(Ler,GrlA,GrlR)等,還有一些功能未知蛋白。
　　 目前,EHEC O157:H7感染致病的效應(yīng)

6、蛋白已增加到20多種,其中效應(yīng)蛋白EspF的作用范圍最大。EspF與線粒體和核仁結(jié)合、與細(xì)胞內(nèi)N-WASP(neuronal
　　 Wiskott-Aldrich syndrome)、SNX9(sorting nexin9)、Abcf2、CK18、SGLT-1、NHE3等蛋白分子結(jié)合,導(dǎo)致上皮細(xì)胞緊密連接破壞、微絨毛消失、腸上皮細(xì)胞骨架重排、肌動(dòng)蛋白聚集、墊狀結(jié)構(gòu)(pedestal)形成,最后細(xì)胞凋亡,在EHECO157:H7感

7、染導(dǎo)致的A/E損傷中起主要作用。
　　 近幾年,不同實(shí)驗(yàn)室對(duì)EspF蛋白在細(xì)胞特異性A/E損傷中的作用進(jìn)行了一定程度的研究,盡管證實(shí)EspF可以突破腸上皮屏障,破壞腸屏障功能,參與破壞腸上皮細(xì)胞緊密連接,但EspF蛋白誘導(dǎo)宿主細(xì)胞死亡的機(jī)制仍然不甚清楚。同時(shí),從目前發(fā)表文獻(xiàn)來(lái)看,研究結(jié)果大多來(lái)自EPEC。雖然EHEC和EPEC均含有LEE4,同源性98％,但其基因編碼的分泌蛋白的差異卻達(dá)34％,兩者破壞腸上皮細(xì)胞緊密連接導(dǎo)致腸屏

8、障功能喪失的動(dòng)力學(xué)機(jī)制也不一樣。EPEC特異性黏附宿主小腸上皮細(xì)胞,而EHEC特異性黏附宿主大腸上皮細(xì)胞。
　　 EHEC和EPEC對(duì)宿主細(xì)胞的致病性和分子機(jī)理卻是不同的,那么,在EHECO157:H7中,EspF蛋白是否具有破壞腸屏障功能,影響腸上皮細(xì)胞緊密連接,誘導(dǎo)細(xì)胞死亡?是否也具有與宿主細(xì)胞線粒體結(jié)合導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡?EHECO157:H7侵襲黏附宿主上皮細(xì)胞后是否導(dǎo)致小腸粘膜層改變或脫落而導(dǎo)致細(xì)胞黏附-抹去損傷?Esp

9、F蛋白怎樣啟動(dòng)了細(xì)胞線粒體死亡途徑?EspF蛋白哪個(gè)功能域在起作用?EspF是否在細(xì)菌致病過(guò)程中是否還有其他作用呢?這方面的問(wèn)題和分子基礎(chǔ)還不十分清楚,國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。
　　 本論文擬揭示EspF蛋白在EHEC O157:H7導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生黏附-抹去損傷中的作用,闡明EHEC導(dǎo)致細(xì)胞黏附-抹去損傷的分子機(jī)制,對(duì)深入探討EHEC O157:H7感染與致病的分子機(jī)制、開(kāi)發(fā)藥物、最終有效控制其暴發(fā)流行,具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值

10、。
　　 二、研究方法：
　　 1.構(gòu)建espF基因缺失突變菌株EHEC O157:H7(ΔespF)
　　 采用生物信息學(xué)方法,分析腸出血性大腸埃希菌O157:H7毒力島LEE4上的espF基因結(jié)構(gòu),確定espF基因N末端編碼線粒體靶向信號(hào)區(qū)MTS的一段核苷酸序列作為擬缺失對(duì)象。采用重疊延伸PCR技術(shù)(gene splicing by overlapextension PCR,簡(jiǎn)稱(chēng)SOE PCR)將espF基因

11、N末端核苷酸序列缺失,克隆到自殺質(zhì)粒pCVD442,構(gòu)建重組自殺性載體pCVD442:ΔespF,轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E coli SM10中,構(gòu)建重組菌株SM10(pCVD442:ΔespF),重組自殺性載體結(jié)合轉(zhuǎn)移,抗性篩選和鑒定EHEC O157:H7(pCVD442:ΔespF),與EHEC O157:H7同源重組,敲出細(xì)菌染色體上的espF基因,篩選和PCR鑒定EHEC O157:H7espF基因缺失突變菌株。
　　 2.

12、野生株和突變株與Lovo細(xì)胞的黏附
　　 EHEC O157:H7野生株和突變株分別作用結(jié)腸癌細(xì)胞Lovo細(xì)胞不同時(shí)間后,經(jīng)吉姆薩染色液染色或固定,在光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡下,觀察野生株和突變株與Lovo細(xì)胞的黏附情況。
　　 3.乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性檢測(cè)
　　 將EHEC O157:H7野生株和突變株加入結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞培養(yǎng),分別在培養(yǎng)2b、4h和6h時(shí)收集上清

13、,通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)各個(gè)時(shí)段上清中的LDH值(波長(zhǎng)為490 nm),并按公式計(jì)算LDH釋放率。
　　 4.EspF蛋白與線粒體結(jié)合并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的研究
　　 用Rho123熒光染料染色Lovo細(xì)胞線粒體,溴乙啶染色EHEC的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核,野生EHEC O157:H7、EHEC O157:H7 espF基因缺失菌株和陰性對(duì)照株分別感染Lovo細(xì)胞,不同時(shí)間段內(nèi)共聚焦激光顯微鏡下觀察EspF蛋白是否與線粒體結(jié)合；激活Caspa

14、se家族蛋白酶-9,-3的活性,啟動(dòng)細(xì)胞線粒體死亡途徑,將細(xì)胞裂解后,SDS-PAGE分離,用細(xì)胞色素C抗體免疫印跡檢測(cè)細(xì)胞色素C。通過(guò)這些研究,研究EspF蛋白能否遷移到宿主腸上皮細(xì)胞,并與線粒體結(jié)合,EspF蛋白能否啟動(dòng)宿主細(xì)胞死亡途徑,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
　　 5.EHEC espF基因缺失菌株感染小鼠
　　 用野生EHEC O157:H7、EHEC O157:H7 espF基因缺失菌株和陰性對(duì)照株分別灌胃感染小鼠,飼

15、養(yǎng)20-30天,觀察小鼠生長(zhǎng)情況和病死率,處死小鼠后觀察比較等段結(jié)腸形態(tài)和腸炎、水腫等病理特征,研究黏附小腸細(xì)菌的重量、數(shù)量,顯微鏡下觀察小腸粘膜層厚度或其他組織病變程度等。
　　 6.EHEC O157:H7 Intimin B細(xì)胞抗原表位的預(yù)測(cè)根據(jù)從GenBank上查到的EHEC O157:H7標(biāo)準(zhǔn)株EDL933 Intimin的氨基酸序列(Acession number:CAA77642),選其C末端300個(gè)氨基酸為目的片

16、斷；采用DNASTAR軟件分析IntC300的親水性、β-轉(zhuǎn)角、柔韌性、表面可及性和抗原指數(shù)；預(yù)測(cè)IntC300的B細(xì)胞抗原趨勢(shì)；綜合各種參數(shù)分析的結(jié)果,預(yù)測(cè)出一組EHEC O157:H7 IntiminB細(xì)胞抗原表位多肽。
　　 7.Intimin B細(xì)胞抗原表位的免疫學(xué)研究合成一條EHEC O157:H7Intimin B細(xì)胞抗原表位多肽KASITEIKADKT,將抗原多肽與KLH偶聯(lián)。將6～8周齡的SPF級(jí)BALB/c小鼠

17、60只,隨機(jī)分為4組:皮下免疫組,皮下免疫對(duì)照組,鼻腔免疫組,鼻腔免疫對(duì)照組,每組15只。將偶聯(lián)產(chǎn)物與弗氏完全佐劑混合后通過(guò)皮下和鼻腔兩種途徑免疫小鼠,對(duì)照組用PBS免疫,每間隔兩周加強(qiáng)免疫一次,2、3次免疫后7天每組隨機(jī)抽10只小鼠從眼眶采集血清,間接ELISA法檢測(cè)小鼠血清抗體效價(jià)。末次免疫10天后以EHEC O157:H7活菌進(jìn)行免疫動(dòng)物的攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn),小鼠于攻毒前禁食、禁水12 h,每只小鼠經(jīng)食道灌注1×1010 CFU/ml

18、EHEC O157:H7活菌0.3 ml。攻毒后12 h恢復(fù)飲食飲水,并記錄動(dòng)物死亡情況。
　　 三、結(jié)果：
　　 1.篩選和鑒定出了EHEC O157:H7 espF基因缺失突變菌株
　　 本實(shí)驗(yàn)獲得了espF缺陷同源性片段ΔespF,大小為1762 bp。經(jīng)測(cè)序比對(duì),全長(zhǎng)747 bp的espF基因中間缺失了162 bp。缺失的位置位于EHEC O157:H7全基因組中的4659104-4659265,EspF

19、蛋白N端的第15-68個(gè)氨基酸。構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMD19T-ΔespF和重組自殺性質(zhì)粒pCVD442-ΔespF,篩選與鑒定同源重組的EHEC O157:H7(ΔespF)。
　　 2.野生株比突變株更易黏附于結(jié)腸癌細(xì)胞Lovo細(xì)胞
　　 通過(guò)光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察,野生株作用于Lovo細(xì)胞2 h后,細(xì)胞膜模糊,細(xì)胞膜表面聚集大量的細(xì)菌。而突變株作用于Lovo細(xì)胞2 h后,可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)完整,細(xì)胞膜邊緣較清晰,膜上見(jiàn)有

20、較少細(xì)菌黏附,未見(jiàn)細(xì)胞膜有明顯損傷。
　　 3.EHEC O157:H7野生株的毒性高于espF基因缺失突變株
　　 酶標(biāo)儀測(cè)定各個(gè)時(shí)段上清中的LDH值后,計(jì)算LDH釋放率,野生株的LDH釋放率顯著高于突變株；細(xì)菌作用后6 h的細(xì)胞LDH釋放率高于2 h和4 h兩組,4 h后細(xì)胞LDH的釋放率高于2 h的；不同時(shí)間點(diǎn)各菌株的LDH釋放率存在顯著差異,野生株6 h組LDH釋放率均值最高,陰性對(duì)照2 h組LDH釋放率均值最低

21、。攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,WT組小鼠死亡3只,小鼠存活率為70％,低于ΔespF組小鼠存活率(P<0.05),說(shuō)明espF基因突變后,細(xì)菌毒力有所下降。
　　 4.突變株導(dǎo)致小鼠結(jié)腸黏附抹去損傷程度比較野生株有所減輕
　　 野生組、突變組和對(duì)照組小鼠經(jīng)相應(yīng)細(xì)菌感染后,接種了EHEC WT菌株的小鼠腸道發(fā)生輕度水腫,固化糞便較少,是細(xì)菌引起的小腸結(jié)腸炎的典型表現(xiàn)；接種了AespF菌株的小鼠腸道較健康,并帶有固化糞便。用小鼠抗EH

22、ECO157:H7抗體進(jìn)行免疫熒光染色觀察,WT組的綠色熒光較ΔespF組綠色熒光多。
　　 5.野生株感染小鼠導(dǎo)致結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡程度高于突變株
　　 采用TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡情況,WT組小鼠結(jié)腸切片發(fā)現(xiàn)明顯綠色熒光,結(jié)腸上皮細(xì)胞出現(xiàn)凋亡；而AespF組小鼠結(jié)腸綠色熒光比WT組較少,其細(xì)胞凋亡情況輕于WT組。LB液體組小鼠結(jié)腸切片未發(fā)現(xiàn)明顯的綠色熒光,說(shuō)明結(jié)腸細(xì)胞無(wú)凋亡情況。

23、　　 6.綜合預(yù)測(cè)了5段EHEC O157:H7 Intimin B細(xì)胞抗原表位
　　 綜合各種參數(shù),預(yù)測(cè)了腸出血性大腸埃希菌O157:H7 Intimin的658-669、711-723、824-833、897-914、919-931等5個(gè)肽段可以作為B細(xì)胞抗原表位。根據(jù)文獻(xiàn)綜合分析,我們選擇EHEC O157:H7 IntC300的658-669肽段序列KASITEIKADKT作為EHEC O157:H7的抗原位點(diǎn)進(jìn)行下一

24、步實(shí)驗(yàn)。
　　 7.658-669肽段抗原表位的合成及免疫保護(hù)作用的研究
　　 合成的多肽與KLH偶聯(lián)后通過(guò)皮下和鼻腔兩種途徑免疫小鼠,結(jié)果顯示兩種途徑免疫小鼠所獲血清均能檢測(cè)到高滴度的IgG抗體,皮下免疫的血清滴度達(dá)到6400,鼻腔免疫為1600。鼻腔免疫獲得的IgA抗體滴度(3200)明顯高于皮下免疫(100)。皮下免疫組攻毒后存活率較低,鼻腔免疫小鼠可以引起小鼠產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答,Intimin的658-669多肽

25、是具有應(yīng)用前景的EHEC O157:H7多肽疫苗的候選抗原。
　　 四、結(jié)論：
　　 本論文：
　　 1.成功構(gòu)建了腸出血性大腸埃希菌O157:H7 espF基因缺失突變株。
　　 2.細(xì)胞感染和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,野生株的毒性明顯高于突變株,野生株與結(jié)腸癌細(xì)胞Lovo細(xì)胞黏附率小于突變株。
　　 3.突變株導(dǎo)致小鼠結(jié)腸黏附抹去損傷程度比較野生株有所減輕。
　　 4.預(yù)測(cè)了EHEC O157:H

26、7 Intimin一段序列為KASITEIKADKTB的細(xì)胞抗原表位。
　　 5.合成多肽免疫后,發(fā)現(xiàn)鼻腔免疫獲得的IgA抗體滴度明顯高于皮下免疫。鼻腔免疫小鼠可以引起小鼠產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答,Intimin的658-669多肽是具有應(yīng)用前景的EHEC O157:H7多肽疫苗的候選抗原。
　　 本論文為進(jìn)一步揭示EspF蛋白在EHEC O157:H7導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生黏附一抹去損傷中的作用,對(duì)深入探討EHEC O157:H