海洋生物來源新化合物SD118-2抗肝癌細(xì)胞HepG2作用及機(jī)制研究.pdf

1、由于對(duì)海洋生物資源的不斷開發(fā)及利用，科研學(xué)者們?cè)谶@十年當(dāng)中逐步的發(fā)現(xiàn)了一些新型的具有抗癌作用價(jià)值的臨床藥物。比如海洋微生物類藥物Eribulin就是一種通過抑制微管動(dòng)力學(xué)起作用的化合物，它通過與癌細(xì)胞微管蛋白結(jié)合來抑制有絲分裂的發(fā)生，從而觸發(fā)癌細(xì)胞凋亡機(jī)制發(fā)揮抗癌效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)當(dāng)中所運(yùn)用的化合物SD118-2(結(jié)構(gòu)式：C18H12N2O2)就是從深海沉積物中提取出來的，它除了具有抗菌的活性以外，在體外還能抑制多種癌細(xì)胞的增殖。
　　

2、 第一部分SD118-2對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖，周期和凋亡的影響
　　 目的：為了檢測(cè)化合物SD118-2對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的增殖效應(yīng)以及對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：以正常的人類肝臟細(xì)胞L02為參照測(cè)定化合物SD118-2對(duì)人類肝癌細(xì)胞HepG2的半數(shù)抑制濃度IC50。通過計(jì)算IC50得出的結(jié)果為參考濃度作用于肝癌細(xì)胞，然后通過流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的情況。
　　 結(jié)果：MTT

3、結(jié)果顯示SD118-2作用于HepG2細(xì)胞48h后可明顯抑制細(xì)胞增殖，其作用具有濃度依賴性，但對(duì)人正常肝細(xì)胞L02顯示出較低的毒性，通過計(jì)算得到半數(shù)抑制濃度IC50為24.3μM，以此濃度為化合物的指導(dǎo)濃度用于HepG2細(xì)胞來檢測(cè)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。流式細(xì)胞分析儀對(duì)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示化合物SD118-2對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響不明顯，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理后發(fā)現(xiàn)沒有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而檢測(cè)出的細(xì)胞凋亡數(shù)也不多，凋亡率不到7％。隨

4、后運(yùn)用了透射電子顯微鏡技術(shù)對(duì)化合物作用HepG2后的形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)為數(shù)不多的凋亡細(xì)胞，意外的發(fā)現(xiàn)在HepG2細(xì)胞質(zhì)中有自噬體的存在，自噬體內(nèi)還包含有殘余的細(xì)胞器。
　　 結(jié)論：化合物SD118-2對(duì)細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，但對(duì)HepG2細(xì)胞周期的改變并不明顯，對(duì)細(xì)胞凋亡的影響也不顯著?；衔颯D118-2通過其它作用方式來影響細(xì)胞的增殖效應(yīng)。
　　 第二部分SD118-2誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2產(chǎn)生自噬及對(duì)信號(hào)通

5、路的影響
　　 目的：進(jìn)一步研究化合物SD118-2誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2產(chǎn)生自噬的過程，明確產(chǎn)生自噬的信號(hào)通路。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：形態(tài)學(xué)方面是通過透射電子顯微鏡來觀察自噬體的存在；生物化學(xué)方面是通過RT-PCR在mRNA水平檢測(cè)自噬相關(guān)基因的表達(dá)；通過westernblotting技術(shù)在蛋白水平驗(yàn)證自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)以及明確化合物SD118-2對(duì)自噬信號(hào)通路的影響。
　　 結(jié)果：SD118-2作用HepG2后通

6、過電鏡觀察不同時(shí)間段的自噬溶酶體；在mRNA水平以Actin為內(nèi)參，檢測(cè)到了自噬相關(guān)基因Beclin1與LC3高度上調(diào)，并具有時(shí)間依賴性；在蛋白水平也證明了自噬相關(guān)蛋白Beclin1的高表達(dá)以及自噬特異性蛋白LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化；在對(duì)自噬信號(hào)通路的研究中我們發(fā)現(xiàn)，以β-actin為內(nèi)參，藥物組與對(duì)照組相比，總的mTOR水平改變不明顯，而磷酸化的mTOR、p-ERK1/2及Bcl-2都隨著化合物作用時(shí)間的延長(zhǎng)而減少。
　　

7、 結(jié)論：SD118-2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生自噬是通過抑制MEK/ERK-mTOR信號(hào)通路和增強(qiáng)Ⅲ型PI3K/Beclin1信號(hào)通路所產(chǎn)生的。
　　 第三部分3-MA抑制后SD118-2的生物學(xué)效應(yīng)
　　 目的：通過運(yùn)用特異性自噬抑制劑3-MA減少自噬后，觀察化合物SD118-2作用HepG2后的效果。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：westernblotting檢測(cè)添加3-MA后自噬蛋白的變化；通過流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)添加3-

8、MA后對(duì)凋亡的影響；通過MTT法檢測(cè)添加3-MA后細(xì)胞增殖情況。
　　 結(jié)果：添加自噬抑制劑3-MA后，凋亡的變化沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而蛋白水平的結(jié)果顯示自噬特異性蛋白Beclin1的表達(dá)大幅度減弱，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化也減少了很多；MTT結(jié)果顯示當(dāng)添加3-MA后，細(xì)胞生存率增加，具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：當(dāng)運(yùn)用自噬抑制劑3-MA后，凋亡率不穩(wěn)定，這就說明了在本實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，化合物SD118-2作用于HepG2

9、細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的自噬與凋亡之間沒有直接關(guān)系。通過westernblotting技術(shù)，我們證實(shí)了3-MA減弱了自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。MTT實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說明了SD118-2誘導(dǎo)HepG2產(chǎn)生的自噬可以引起自噬性細(xì)胞死亡。
　　 綜上所述，從深海沉積物中提取出來的化合物SD118-2在體外能抑制多種癌細(xì)胞的增殖。我們的研究發(fā)現(xiàn)化合物SD118-2作用于HepG2不引起明顯的細(xì)胞凋亡，能使大部分幸存細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生自噬，所被誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞自噬是通