基因表達(dá)系列分析對丹皮酚胂化合物作用的人肝癌細(xì)胞HepG2基因表達(dá)的初步研究.pdf

1、肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，是我國位居第二的癌癥“殺手”，但現(xiàn)在還缺乏治療肝癌的有效藥物，研究篩選抗肝癌的藥物是我國面臨的重要抗癌任務(wù)。在分子腫瘤學(xué)取得迅速進(jìn)展的今天，抗癌藥物的篩選將由針對疾病的篩選轉(zhuǎn)向針對機(jī)制的篩選，其關(guān)鍵是尋找可供治療干預(yù)的特殊分子靶點(diǎn)，也就是找到正常細(xì)胞與癌細(xì)胞之間的生化與分子差異。因此，如果對腫瘤發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究，試圖找到一種全面分析評價(jià)抗腫瘤藥物對腫瘤作用機(jī)制的方法，將為抗腫瘤藥物的篩選提供

2、一個新的策略。 本文利用LongSAGE技術(shù)，定性和定量研究丹皮酚胂化物2-甲氧基-4-羥基-5-乙?；嫉?4-胂酸（R2）對人肝癌細(xì)胞HepG2基因表達(dá)差異的影響，尋找其作用的分子靶點(diǎn)，探討丹皮酚胂化物抗肝癌作用的分子機(jī)制。 以丹皮酚胂化物R2作用的人肝癌HepG2細(xì)胞作為研究對象，提取總RNA，用生物素的磁珠逆轉(zhuǎn)錄合成雙鏈的cDNA，用錨定酶Nla Ⅲ酶切cDNA，將酶切的cDNA片段分成兩份,分別與連接子A、B

3、連接。用標(biāo)簽酶MmeⅠ酶切連接子和cDNA結(jié)合的序列，釋放出帶有連接子的標(biāo)簽，使用T4 DNA連接酶連接帶有連接子A、B的標(biāo)簽，形成130bp的雙標(biāo)簽，并進(jìn)行大規(guī)模PCR擴(kuò)增。錨定酶Nla Ⅲ切除連接子A、B，得到34bp雙標(biāo)簽，再把雙標(biāo)簽連接成串聯(lián)體，最后將串聯(lián)體克隆轉(zhuǎn)化測序。用SAGE2000軟件對序列進(jìn)行分析，獲得丹皮酚胂化物作用人HepG2細(xì)胞的LongSAGE標(biāo)簽庫。將構(gòu)建好的LongSAGE標(biāo)簽庫與SAGEmap中人的肝癌組

4、織的SAGE標(biāo)簽庫進(jìn)行比對，從而了解R2作用后人肝癌細(xì)胞基因表達(dá)差異的情況。 從構(gòu)建好的LongSAGE標(biāo)簽庫中挑選克隆45個，進(jìn)行測序，測序一共得到標(biāo)簽675個，特異性標(biāo)簽為401個，其中單一匹配標(biāo)簽263個，占66％，多重匹配標(biāo)簽57個，占14％，新標(biāo)簽81個，占20％。在構(gòu)建好的LongSAGE標(biāo)簽庫與人的肝癌的SAGE標(biāo)簽庫之間，基因表達(dá)存在明顯差異，主要差異表達(dá)的基因有PAFAH2、MCM3、CTPS、GFM2、HSP

5、70、TMSB4X 、TXNRD1、CYP3A4、MAP2K2、SET、CASP8、OXCT1等。結(jié)果表明，R2通過下調(diào)了PAFAH2、MCM3、CTPS、GFM2、HSP70的表達(dá)，上調(diào)了TMSB4X 、TXNRD1、CYP3A4、MAP2K2、SET、CASP8、OXCT1的表達(dá)而發(fā)揮著抗肝癌的作用。 SAGE方法能較完整地、定量地獲得基因表達(dá)信息，識別丹皮酚胂化物抗肝癌作用的分子靶點(diǎn)，有助于闡明丹皮酚胂化物作用的分子機(jī)制，