大鼠再生肝抗CCl-,4-損傷的動(dòng)態(tài)變化及UCP2的作用研究.pdf

1、目的：肝臟具有很強(qiáng)的再生能力，是肝臟對(duì)于切除或毒性損害后的一種代償反應(yīng)。大鼠肝切除70﹪后，殘余肝臟再生過程于肝部分切除后數(shù)小時(shí)內(nèi)啟動(dòng)并于7～10天后結(jié)束。再生肝臟有一重要的生理特征，即具有很強(qiáng)的抗損傷能力。已知再生肝對(duì)于四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl<,4>)等肝毒劑有一定的抗損傷能力，但不同時(shí)間點(diǎn)的再生肝，其抗損傷能力還不十分清楚，如果能動(dòng)態(tài)觀察不同時(shí)間點(diǎn)再生肝抗損傷及其相關(guān)生理、生化指標(biāo)的變化，將使我們

2、進(jìn)一步了解再生肝抗損傷的機(jī)制。對(duì)于抗損傷機(jī)制的研究，不僅可以深入認(rèn)識(shí)肝臟生理活動(dòng)的規(guī)律，揭示肝再生的調(diào)控機(jī)制，也將為臨床肝病、部分切除甚至移植等肝損傷與再生的應(yīng)用提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)的目的是觀察不同時(shí)間點(diǎn)的再生肝抗四氯化碳損傷能力的變化。 解偶聯(lián)蛋白2(uncoupling protein 2，UCP2)是晚近發(fā)現(xiàn)的線粒體內(nèi)膜解偶聯(lián)蛋白家族成員，廣泛分布于嚙齒類動(dòng)物的多種組織。目前，UCP2的生理功能尚不十分清楚。實(shí)驗(yàn)證

3、據(jù)表明，UCP2可以降低ROS產(chǎn)生，在細(xì)胞受到氧化損傷時(shí)起保護(hù)作用。CCl<,4>是常用的肝毒劑，在肝細(xì)胞微粒體經(jīng)P-450酶代謝，引起肝細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生增加。大量ROS介導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷，參與許多肝毒劑的肝損害過程，因此肝細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除成為肝臟抗損傷的關(guān)鍵問題。因此我們推測(cè)LJCP2可能通過其降低ROS的功能參與再生肝的抗損傷機(jī)制。另外，UCP2作為線粒體內(nèi)膜上的離子

4、通道，可引發(fā)質(zhì)子從線粒體膜間腔回流至基質(zhì)(質(zhì)子漏)，降低線粒體內(nèi)膜質(zhì)子跨膜梯度，導(dǎo)致氧化磷酸化解偶聯(lián)。如此以來UCP2的表達(dá)可能降低細(xì)胞內(nèi)的能量儲(chǔ)備，使細(xì)胞更易受到毒物損傷。本研究通過實(shí)驗(yàn)，觀察了UCP2在ROS和ATP之間的調(diào)節(jié)功能及其對(duì)細(xì)胞的影響，并探討了UCP2在肝再生不同時(shí)間點(diǎn)抗損傷中的作用。 方法：健康雄性 Wistar大鼠，隨機(jī)分為4組：正常組(control)，假手術(shù)損傷組(SO/CCl<,4>．)，肝切組(PH

5、)和肝切損傷組(PH/CCl<,4>)，正常組5只大鼠，其余3組，每組20只，分別于術(shù)后24h、48h、72h、96h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。乙醚麻醉下進(jìn)行手術(shù)，肝切手術(shù)按文獻(xiàn)方法切除2/3肝組織。假手術(shù)損傷組大鼠除不實(shí)施肝切外，其余操作與肝切組相同。本研究選用CCl<,4>做肝毒劑。手術(shù)后對(duì)假手術(shù)損傷組和肝切損傷組分別在術(shù)后24h、48h、72h、96h，按5ml/kg體重給予50﹪CCl<,4>(CCl<,4>∶豆油=1∶1)灌胃，肝切組按同樣劑

6、量和方式只給豆油。給藥24h后將大鼠斷頭處死，取血檢測(cè)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine amiotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartateaminotransferase，AST)水平；取肝組織制勻漿檢測(cè)丙二醛(malondialdehyde，MDA)和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)的含量。另取肝組織制備線粒體，檢測(cè)線粒體膜電位(mitochondrial membrane pot

7、ential，MMP)。制作肝組織石蠟切片，HE染色觀察肝形態(tài)學(xué)改變，免疫組織化學(xué)染色觀察肝組織中UCP2和增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)的表達(dá)。Western blot方法檢測(cè)肝線粒體內(nèi)UCP2表達(dá)并進(jìn)行定量分析。結(jié)果： 1．肝再生不同時(shí)間點(diǎn)CCl<,4>損傷后肝組織形態(tài)的改變HE染色結(jié)果顯示，正常組肝細(xì)胞形態(tài)正常，中央靜脈周圍肝細(xì)胞索排列緊密；假手術(shù)損傷組大

8、鼠肝細(xì)胞索狀排列紊亂，炎性和壞死細(xì)胞增多，出現(xiàn)脂肪樣變。肝切24h損傷組肝組織中有廣泛、大量的肝細(xì)胞氣球、脂肪樣變，有出血及炎細(xì)胞浸潤，部分細(xì)胞壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，條索狀排列消失；隨著肝切除后肝臟的再生，肝組織中脂肪樣變、壞死、出血及炎細(xì)胞浸潤逐漸減少，肝小葉結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)，條索狀排列出現(xiàn)；至肝切96h損傷組時(shí)再生肝細(xì)胞肝小葉結(jié)構(gòu)破壞較輕，條索排列保留，只有輕度的脂肪變性，局部區(qū)域有炎細(xì)胞浸潤，無肝細(xì)胞壞死。 2．肝再生不同

9、時(shí)間點(diǎn)CCl<,4>．損傷后血清中ALT、AST 含量的變化CCl<,4>損傷后肝細(xì)胞內(nèi)ALT、AST釋放入血，肝切損傷組血清ALT、AST 水平在24h時(shí)均顯著上升，約為假手術(shù)損傷組的3倍(P<0.001)。隨著肝的再生，血清ALT、AST水平逐漸下降，至96h時(shí)ALT、AST水平明顯低于假手術(shù)損傷組(P<0.001)，也明顯低于24h的ALT、AST水平(P<0.001)。 3．肝再生不同時(shí)間點(diǎn)CCl<,4>損傷后肝組織中

10、MDA含量的變化CCl<,4>損傷后再生肝組織內(nèi)的MDA含量在24h時(shí)升高，明顯高于假手術(shù)損傷組(P<0.001)；隨著肝再生時(shí)間的延長肝組織中MDA含量逐漸降低，至96h時(shí)肝組織中MDA含量低于假手術(shù)損傷組(P<0.01)和24h(P<0.001)。 4．肝再生不同時(shí)間點(diǎn)CCl<,4>損傷后肝組織內(nèi)ATP水平的改變CCl<,4>損傷后肝組織中ATP含量在24h時(shí)明顯降低，與假手術(shù)損傷組相比有顯著性差異(P<0.001)，隨著肝

11、臟不斷的再生，ATP水平逐漸升高，至96h時(shí)明顯高于假手術(shù)損傷組(P<0.001)和24h組(P<0.001)。 5．肝再生不同時(shí)間點(diǎn)CCl<,4>損傷后肝細(xì)胞線粒體膜電位的變化CCl<,4>損傷后肝細(xì)胞線粒體膜電位在24h時(shí)明顯高于假手術(shù)損傷組(P<0.01)；96h時(shí)的線粒體膜電位與假手術(shù)損傷組相比明顯升高(P<0.001)，也高于24h(P<0.01)。 6.肝再生不同時(shí)間點(diǎn)CCl<,4>損傷后肝組織UCP2的表達(dá)

12、免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，正常組肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)不表達(dá)UCP2。在假手術(shù)損傷組和肝切損傷組中，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)均有棕黃色陽性顆粒分布。肝切24h損傷組UCP2表達(dá)最豐富，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞胞漿內(nèi)幾乎充滿陽性顆粒；肝切96h損傷組UCP2表達(dá)也較豐富。Western blot實(shí)驗(yàn)定量分析表明，CCl<,4>損傷后肝組織中的UCP2表達(dá)在24h和96h時(shí)均明顯高于假手術(shù)損傷組(P<0.001)，但96h時(shí)UCP2表達(dá)明顯低于24h的UCP2表達(dá)(P<0.001

13、)。 7.肝再生不同時(shí)間點(diǎn)CCl<,4>損傷后肝組織PCNA的表達(dá)免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，正常情況下僅見少數(shù)PCNA陽性肝細(xì)胞，表達(dá)也較弱。假手術(shù)損傷組PCNA陽性細(xì)胞明顯增多；肝切除后肝再生過程中，肝切24h損傷組PCNA陽性肝細(xì)胞數(shù)量多，表達(dá)也較強(qiáng)，術(shù)后48h達(dá)到高峰，以后PCNA表達(dá)迅速減弱，至96h時(shí)PCNA表達(dá)與正常組相近。 結(jié)論： 1.CCl<,4>可通過ROS水平的升高引起肝細(xì)胞的損傷。 2