重組Akt腺病毒對CCL-,4-誘導(dǎo)肝纖維化大鼠模型的影響.pdf

1、肝纖維化是諸多慢性肝病發(fā)展至肝硬化過程中所共有的病理組織學(xué)改變，是影響慢性肝病預(yù)后的重要環(huán)節(jié)。肝纖維化為一動態(tài)過程，屬可逆性病變。但若進(jìn)一步發(fā)展致肝小葉結(jié)構(gòu)改建、假小葉形成(肝硬化階段)則不可逆。迄今為止，臨床上還缺乏公認(rèn)的確切有效的抗肝纖維化藥物問世，肝纖維化的防治研究在今后一定時期內(nèi)仍是國內(nèi)外的熱點(diǎn)與難點(diǎn)課題。 細(xì)胞凋亡是機(jī)體清除不必要細(xì)胞的重要途徑，維持正常組織器官的功能。在生理條件下，細(xì)胞凋亡是由基因嚴(yán)格控制的細(xì)胞自主的

2、有序的死亡。在健康的生物中，為了確保正常的器官功能，通過細(xì)胞凋亡所清除的細(xì)胞數(shù)等于通過有絲分裂所產(chǎn)生的細(xì)胞數(shù)。然而，在病理情況下，細(xì)胞增值與細(xì)胞死亡之間的平衡被破壞，導(dǎo)致組織內(nèi)平衡狀態(tài)被打破，從而引起多種肝臟疾病的產(chǎn)生?，F(xiàn)有的研究表明在急性和慢性病毒性肝炎中，往往表現(xiàn)為肝細(xì)胞的過度凋亡；持續(xù)性的細(xì)胞凋亡與肝纖維化、肝硬化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)；相反地，在肝細(xì)胞性肝癌中，則表現(xiàn)為肝細(xì)胞凋亡減少。因此，有學(xué)者提出通過調(diào)節(jié)已失衡的細(xì)胞凋亡來治療

3、肝臟疾病。 Akt又名蛋白激酶B(PKB)。Akt能使絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)磷酸化，故又稱為絲氨酸/蘇氨酸激酶。Akt能介導(dǎo)多種生物學(xué)效應(yīng)，是重要的抗凋亡調(diào)節(jié)因子。最近有學(xué)者利用Akt的這一特性來治療一些以病理性細(xì)胞凋亡為主要病變的疾病，如：心肌缺血、阿爾茨海默病、帕金森病和肝細(xì)胞缺血再灌注損傷等，并在實(shí)驗中取得了良好的效果。 有鑒于此，本研究以細(xì)胞內(nèi)同源重組法構(gòu)建復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad-myr-HA-Akt

4、，并經(jīng)尾靜脈途徑導(dǎo)入大鼠體內(nèi)，以研究其對CCL4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的影響及其作用機(jī)制。 方法： 1.方法：50只雄性SD大鼠隨機(jī)分為兩組，實(shí)驗組(40只)采用復(fù)合因素法即：皮下注射40％四氯化碳.花生油溶液0.3ml/100g體重，每周2次。第二周開始，以10％酒精作為惟一飲料，自由飲用。飼以混有0.5％膽固醇的玉米粉飼料。對照組(10只)自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料及飲水，皮下注射生理鹽水，頻率、劑量和持續(xù)時間同實(shí)驗組。8周后

5、取肝組織行HE、VG染色。免疫印跡法檢測正常大鼠和肝纖維化大鼠肝組織內(nèi)Akt和p-Akt蛋白的表達(dá)。 2.酶切正向插入目的基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-myr-HA-Akt，獲得myr-HA-Akt cDNA，然后將其定向克隆到穿梭質(zhì)粒pDC316中，然后將重組質(zhì)粒與病毒骨架質(zhì)粒pBHGloxΔE1，3Cre共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，獲得復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad-myr-HA-AKL)并進(jìn)行擴(kuò)增、純化。通過觀察腺病毒感染293細(xì)胞

6、后是否出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)、PCR和基因測序方法對所構(gòu)建病毒進(jìn)行鑒定，并采用TCID50法檢測病毒滴度。重組腺病毒Ad-myr-HA-Akt自尾靜脈途徑感染用四氯化碳復(fù)合法制備肝纖維化模型大鼠。免疫印跡法檢測大鼠肝組織內(nèi)Akt和p-Akt蛋白的表達(dá)。 3.取10只正常大鼠設(shè)為正常組。另取60只大鼠隨機(jī)分成4組：肝纖維化組、生理鹽水組、EGFP組和Akt組。采用四氯化碳復(fù)合法制備肝纖維化大鼠模型。整個造模時間為8周。生理鹽水組、EGF

7、P組和Akt組在造模第2周和第6周分別自尾靜脈導(dǎo)入生理鹽水、Ad-EGFP和Ad-myr-HA-Akt。8wk后所有動物取肝組織標(biāo)本，常規(guī)Van Gieson(VG)膠原染色，檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、白蛋白(ALB)和羥脯氨酸(Hyp)。采用免疫組化方法觀察各組肝組織Fas的表達(dá)情況。采用Annexin V FITC/P1流式細(xì)胞術(shù)檢測各組肝細(xì)胞的凋亡。應(yīng)用Western blot法檢測各組大鼠

8、肝組織內(nèi)Akt、p-Akt、Fas、caspase 3、caspase 9、DR5和a-SMA蛋白的表達(dá)。EGFP組大鼠，取心、肝、脾、肺、腎、腦和睪丸，快速冰凍切片，觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果： 1.實(shí)驗組40只大鼠造模結(jié)束時，死亡5只，死亡率12.5％。實(shí)驗結(jié)束時，按照成模標(biāo)準(zhǔn)，造模成功大鼠共為28只，成模率80％。在肝纖維化大鼠肝臟內(nèi)Akt的活化(磷酸化)受到了抑制。 2.感染的293細(xì)胞出現(xiàn)了明顯

9、的細(xì)胞病變效應(yīng)，PCR產(chǎn)物電泳證實(shí)了重組腺病毒的存在，基因測序證實(shí)myr-HA-Akt的cDNA正確插入穿梭質(zhì)粒且與pBHGloxΔE1，3Cre正確同源重組；病毒滴度為5.5x1011vp/ml。在蛋白水平證實(shí)感染病毒的肝纖維化模型大鼠有外源性Akt基因的表達(dá)。 3.Akt重組腺病毒治療組在應(yīng)用Ad-myr-HA-Akt治療后組織學(xué)病變減輕，免疫組化顯示其Fas蛋白的表達(dá)明顯低于肝纖維化組、生理鹽水組和EGFP組；肝細(xì)胞凋亡率

10、和血清ALT和AST及反映膠原沉積指標(biāo)的Hyp均亦顯著低于肝纖維化組、生理鹽水組和EGFP組。Akt重組腺病毒治療組p-Akt蛋白的表達(dá)明顯高于肝纖維化組、生理鹽水組和EGFP組，而反映細(xì)胞凋亡的Fas、caspase 3、caspase 9和HSC活化的指標(biāo)DR5、a-SMA蛋白的含量則相應(yīng)低于肝纖維化組、生理鹽水組和EGFP組。EGFP組在Ad-EGFP轉(zhuǎn)染后，肝組織中可見大量綠色熒光，肺和腎組織中僅見少量熒光，而其他實(shí)質(zhì)器官未見E