針對TGF-β1腺病毒siRNA的制備及對模型大鼠肺間質(zhì)纖維化的影響.pdf

1、肺纖維化是一組以肺間質(zhì)彌漫性滲出、浸潤和纖維化為主要病變的疾病，發(fā)病機(jī)制迄今尚不十分清楚，主要涉及到多種炎癥細(xì)胞、免疫細(xì)胞及其分泌的介質(zhì)和細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)過程中出現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)紊亂、氧自由基損傷、膠原代謝失衡等。早期病變基礎(chǔ)是急性肺泡炎，在肺泡炎形成過程中多種炎性細(xì)胞、免疫效應(yīng)細(xì)胞活化，分泌大量細(xì)胞因子，某些細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)，它們在組織損傷和修復(fù)中發(fā)揮了重要的作用。因其病因復(fù)雜

2、，臨床上缺乏有效的治療手段，所以預(yù)后極差。疾病后期為大量的成纖維細(xì)胞的病理性增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的進(jìn)行性聚集，逐步取代正常的肺組織結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)限制性通氣功能障礙、肺一氧化碳彌散量(DLco)降低，最終導(dǎo)致呼吸衰竭而死亡。近年來，肺間質(zhì)纖維化疾病的發(fā)病率和病死率呈逐年遞增的趨勢，給患者及社會(huì)帶來了極大的危害。
　　 機(jī)體大多數(shù)組織和細(xì)胞都可以產(chǎn)生TGF-β1，如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、粒細(xì)胞、血小板、氣道上皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞等。TG

3、F-β1是一種多效性細(xì)胞因子，其生物學(xué)功能包括調(diào)控胚胎的發(fā)育、調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、減輕炎癥反應(yīng)、參與組織的損傷修復(fù)和調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和降解等。已有的研究結(jié)果顯示，在肺間質(zhì)纖維化的形成及發(fā)展的過程中，TGF-β1水平顯著升高，經(jīng)用糖皮質(zhì)激素或抗TGF-β1治療后肺間質(zhì)纖維化的病理程度明顯減輕；敲出TGF-β1基因可明顯減輕小鼠博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化。因此，TGF-β1被認(rèn)為是肺間質(zhì)纖維化形成和發(fā)展過程中的最關(guān)鍵的“開關(guān)

4、性”細(xì)胞因子。目前，TGF-β1在肺間質(zhì)纖維化中的作用已被眾多實(shí)驗(yàn)證實(shí)，通過阻斷TGF-β1的產(chǎn)生或抑制其生物活性能夠有效地抑制肺纖維化的發(fā)生發(fā)展，提示干擾TGF-β1可能是抗肺纖維化治療較為理想的手段。
　　 為了更進(jìn)一步證實(shí)TGF-β1在大鼠肺間質(zhì)纖維化模型中對疾病進(jìn)展的延緩作用，本研究首次采用RNAi技術(shù)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對TGF-β1在肺間質(zhì)纖維化中的作用進(jìn)行了全面、系統(tǒng)的研究，得出如下結(jié)論：成功構(gòu)建針對TGF-β1 siRN

5、A腺病毒表達(dá)載體并包裝得到腺病毒顆粒，并在細(xì)胞水平證實(shí)其干擾效果；然后用氣管內(nèi)滴入博萊霉素的方法建立大鼠肺間質(zhì)纖維化模型；通過鼻腔滴入TGF-β1siRNA腺病毒干預(yù)后，肺間質(zhì)纖維化程度明顯減輕；干預(yù)后支氣管肺泡灌洗液及外周血中TGF-β1的表達(dá)水平不同。該研究旨在為以TGF-β1為靶點(diǎn)的肺間質(zhì)纖維化的分子靶向治療提供新的思路和可行性的臨床依據(jù)。
　　 第一部分沉默TGF-β1基因表達(dá)的siRNA腺病毒制備及效果分析
　　

6、 方法：
　　 (1)TGF-β1的siRNA的特異性靶序列和無關(guān)對照序列的設(shè)計(jì)：依據(jù)GenBank中TGF-β1的基因(NM_000660)序列，使用Clontech公司的RNAi Designer軟件，設(shè)計(jì)出針對TGF-β1的siRNA的特異性靶序列和無關(guān)對照序列。
　　 (2)pSIREN-Shuttle-TGF-β1 siRNA的構(gòu)建：將上述設(shè)計(jì)的序列在一定條件下退火，利用T4 DNA連接酶將退火產(chǎn)物與pSIR

7、EN-Shuttle載體連接，分別得到pSIREN-Shuttle-siTGF和pSIREN-Shuttle-siCon載體。
　　 (3)siRNA表達(dá)盒的制備：利用PI-SceI/I-CeuI雙酶切pSIREN-Shuttle-siTGF和pSIREN-Shuttle-siCon即獲得siRNA表達(dá)盒(siTGF和siCon)。
　　 (4)TGF-β1 siRNA重組腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定：分別將上述表達(dá)盒重組

8、入腺病毒載體pAdeno-X，構(gòu)建重組腺病毒表達(dá)載體pAdeno-X-siTGF和pAdeno-X-siCon。然后利用DNA測序證實(shí)插入序列。
　　 (5)腺病毒載體的包裝：利用Pac I酶切重組腺病毒質(zhì)粒pAdeno-X-siTGF和pAdeno-X-siCon，用LipofectamineTM2000將線性化的pAdeno-X-siTGF和pAdeno-X-siCon轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中，12～14d后，裂解細(xì)胞并收集

9、病毒上清，純化、測定病毒滴度后保存于-80℃?zhèn)溆谩?br>　　 (6)干擾效果的測定：將病毒上清感染肺腺癌A549細(xì)胞，于48h收集細(xì)胞，利用RT-PCR和Western blot方法檢測A549細(xì)胞中TGF-β1 mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 (1)TGF-β1及對照發(fā)卡樣siRNA單鏈DNA寡核苷酸退火后，電泳可見明顯條帶，位于100bp以下，接近100bp，與設(shè)計(jì)完全一致。
　　 (2)成功

10、構(gòu)建了pSIREN-Shuttle-TGF-β1 siRNA重組載體。
　　 (3)成功構(gòu)建TpAdeno-X-TGF-β1 siRNA的表達(dá)載體。
　　 (4)RT-PCR結(jié)果顯示，siRNA干預(yù)1組和siRNA干預(yù)2組與空白對照組、空載體組、無關(guān)siRNA對照組相比TGF-β1mRNA的表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中siRNA干預(yù)2組的沉默效果優(yōu)于siRNA干預(yù)1組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示TGF-β1第2

11、019-2037位的編碼序列的沉默效果較好；空白對照組、無關(guān)siRNA對照組與空載體組間無明顯差異，TGF-β1mRNA的表達(dá)水平均較高。
　　 (5)Western blot結(jié)果顯示，空載體組、無關(guān)siRNA對照組、siRNA干預(yù)1組、siRNA干預(yù)2組與空白對照組相比，細(xì)胞中TGF-β1蛋白的表達(dá)水平均有不同程度的升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中，空載體組和無關(guān)siRNA對照組升高最明顯，此兩者比較無明顯差別；siRNA干預(yù)1組

12、和siRNA干預(yù)2組與空載體組和無關(guān)siRNA對照組相比，細(xì)胞中TGF-β1蛋白的表達(dá)水平略有降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中，siRNA干預(yù)2組細(xì)胞中TGF-β1蛋白的表達(dá)水平下降較siRNA干預(yù)1組下降明顯。
　　 第二部分 TGF-β1 siRNA重組腺病毒干預(yù)大鼠肺間質(zhì)纖維化模型的實(shí)驗(yàn)研究
　　 方法：
　　 (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：雄性SD大鼠75只(購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，體重220g(220±20g)，

13、隨機(jī)分為4組：空白對照組(15只)、模型對照組(20只)、無關(guān)siRNA對照組(20只)和siRNA干預(yù)組(20只)。
　　 (2)大鼠腫間質(zhì)纖維化模型的建立：用10％的水合氯醛(40mg/kg)腹腔注射麻醉，無菌條件下做頸部正中切口，經(jīng)氣管軟骨環(huán)朝向心端插入注射器，模型對照組、無關(guān)siRNA對照組、siRNA干預(yù)組一次性緩慢注入含博萊霉素0.2-0.3ml的生理鹽水溶液，繼續(xù)注入0.3ml空氣，以便使藥液充分注入肺內(nèi)，空白對照

14、組滴入等量的生理鹽水。注入后立即旋轉(zhuǎn)大鼠，使藥液在肺內(nèi)均勻分部，切口縫合，常規(guī)消毒，待大鼠清醒后正常喂養(yǎng)。
　　 (3)TGF-β1 siRNA治療大鼠肺間質(zhì)纖維化：24h后，空白對照組、模型對照組分別經(jīng)鼻滴入100μl/鼠的生理鹽水，無關(guān)siRNA對照組、siRNA干預(yù)組分別滴入等量體積的重組腺病毒pAdeno-X-siCon和pAdeno-X-siTGF。分別于造模后第7、14、28d腹腔注射麻醉后，腹主動(dòng)脈放血法處死大鼠，

15、進(jìn)行取材，每次各組隨機(jī)處死5只，分別進(jìn)行肺組織病理學(xué)形態(tài)觀察及分子生物學(xué)檢測。
　　 (4)TGF-β1 mRNA和蛋白的表達(dá)的檢測：利用RT-PCR和Western blot法檢測肺組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原及TGF-β1mRNA和蛋白的表達(dá)，并采用免疫組化法檢測肺組織TGF-β1蛋白的表達(dá)。并采用ELISA法檢測肺泡灌洗液和外周血中TGF-β1的表達(dá)。
　　 (5)超氧化物歧化酶活性的測定：利用ELISA法檢測肺泡灌洗液和外

16、周血中超氧化物歧化酶(SOD)的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 (1)肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察：空白對照組各觀察時(shí)間點(diǎn)肺組織均結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯的肺泡間隔纖維化增厚等變化。模型對照組及無關(guān)siRNA對照組病變基本相似，各觀察時(shí)間點(diǎn)均可見肺組織結(jié)構(gòu)破壞，纖維化形成，其中第28d纖維化最為顯著，主要表現(xiàn)為肺泡間隔不同程度纖維化增厚并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤。siRNA干預(yù)組處理后，各觀察時(shí)間點(diǎn)大鼠肺組織纖維化程度顯著較模型組及無關(guān)s

17、iRNA組輕，其中第28d纖維化減輕程度最為顯著。
　　 (2)免疫組化法觀察大鼠肺組織中TGF-β1蛋白的表達(dá)：模型對照組與無關(guān)siRNA對照組在各觀察期肺組織中TGF-β1蛋白的表達(dá)量均無顯著性差異，同時(shí)二者都較空白對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；siRNA干預(yù)組第7d、14d肺組織中TGF-β1蛋白的表達(dá)量與空白對照組比較顯著升高，與模型對照組和無關(guān)siRNA對照組比較顯示降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第28dTGF-β1蛋

18、白的表達(dá)量顯著低于模型對照組和無關(guān)siRNA對照組，但仍高于空白對照組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (3)肺組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原及TGF-β1 mRNA和蛋白的表達(dá)：模型對照組、無關(guān)siRNA對照組及siRNA干預(yù)組各期Ⅰ、Ⅲ型膠原及TGF-β1 mRNA和蛋白的表達(dá)量比空白對照組均有顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；siRNA干預(yù)組與模型對照組和無關(guān)siRNA對照組相比有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；模型對照組與無關(guān)siRNA對照組各期相比

19、無明顯差別。
　　 (4)肺泡灌洗液和外周血中TGF-β1和SOD的表達(dá)水平：肺泡灌洗液中，TGF-β1的表達(dá)水平，各觀察期模型對照組、無關(guān)siRNA對照組及siRNA干預(yù)組較空白對照組TGF-β1的含量有不同程度的升高；siRNA干預(yù)組與模型對照組、無關(guān)siRNA對照組相比有所降低；模型對照組與無關(guān)siRNA對照組相比無明顯差別。在外周血中，各期各組間相比TGF-β1和SOD的含量無明顯差別。
　　 結(jié)論：
　　

20、 (1)成功構(gòu)建出TGF-β1 siRNA腺病毒表達(dá)載體，并鑒定了2條對TGF-β1表達(dá)具有明顯抑制作用的靶序列。
　　 (2)TGF-β1 siRNA腺病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)入肺腺癌A549細(xì)胞中能明顯抑制A549細(xì)胞中TGF-β1 mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　 (3)TGF-β1 siRNA重組腺病毒載體可抑制博萊霉素所致大鼠肺間質(zhì)纖維化肺組織中TGF-β1 mRNA、TGF-β1蛋白及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)。