galectin-3在CCl-,4-肝損傷中作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的:肝臟是人體重要的解毒器官，當(dāng)人體攝入大量的化學(xué)藥物時(shí)將發(fā)生肝細(xì)胞壞死，甚至導(dǎo)致急性肝衰竭。為了深入研究急性肝損傷發(fā)生的分子機(jī)制，建立急性肝損傷的動(dòng)物模型是十分必要的，用四氯化碳(CCl4)給鼠灌胃造成的肝損傷動(dòng)物模型長(zhǎng)期應(yīng)用于肝損傷的研究領(lǐng)域，但CCl4引起肝損傷的機(jī)制尚未完全闡明。目前一般認(rèn)為，四氯化碳在肝細(xì)胞微粒體內(nèi)，在酶的作用下，碳?xì)滏I發(fā)生斷裂產(chǎn)生自由基，自由基可以激發(fā)細(xì)胞生物膜上脂質(zhì)的多價(jià)不飽和脂肪酸發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生脂

2、質(zhì)過(guò)氧化物。脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)是鏈鎖式的，連續(xù)不斷地進(jìn)行，消耗大量脂質(zhì)，產(chǎn)生大量脂質(zhì)過(guò)氧化物，造成細(xì)胞生物膜的損害，嚴(yán)重者可導(dǎo)致細(xì)胞崩潰，使肝臟遭受損害。平賀等在CCl4誘導(dǎo)急性損傷24到72小時(shí)的鼠肝臟細(xì)胞漿中發(fā)現(xiàn)了一種30kDa的蛋白，經(jīng)免疫蛋白印跡確定為galectin-3(Gal-3)，并與酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化。該時(shí)相的肝細(xì)胞漿或核內(nèi)表達(dá)p21(WAF1/Cip1/Sdi1)和PCNA蛋白，提示galectin-3在肝損傷24到72

3、h時(shí)可能參與肝細(xì)胞的修復(fù)和生存。Gal-3是一個(gè)分子量為30kDa的β-半乳糖血凝素超家族成員，存在于所有的胚胎細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中，正常成體細(xì)胞不表達(dá)，現(xiàn)在雖然知道她具有很多功能，但除細(xì)胞黏附、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和作為advancedglycationendproduct受體(RAGE)的功能外，在分子水平其功能的研究很少。而Gal-3在肝損傷中的作用機(jī)制研究更少，因此有必要研究Gal-3在肝損傷中的作用機(jī)制。 為了探討galectin-3

4、在CCl4肝損傷中作用機(jī)制，給Gal-3基因敲出(Gal-3(-/-)鼠和野生型(Gal-3(+/+))鼠CCl4灌胃、以凋亡表達(dá)的調(diào)控蛋白酶及分子伴侶GRP78做為指標(biāo)觀察不同時(shí)間點(diǎn)分子水平表現(xiàn)型的變化，探討galectin-3在CCl4肝損傷中抗凋亡機(jī)制。 大量研究表明Gal-3通過(guò)含半乳糖苷的胍基乙酸內(nèi)酰胺與靶分子結(jié)合參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑。尋找與Gal-3結(jié)合的高分子物質(zhì)成為探討Gal-3在肝損傷過(guò)程中分子生物學(xué)意義的一個(gè)

5、基礎(chǔ)問(wèn)題。我們?cè)谟每笹al-3抗體進(jìn)行免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在野生鼠CCl4灌胃后有一65kDa大小蛋白與Gal-3的表達(dá)有密切關(guān)系，即在24小時(shí)到72小時(shí)間高表達(dá)，為弄清該蛋白的性質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)層析分離，尋找并分離純化一種Gal-3復(fù)合體，為進(jìn)一步深入研究提供方向。 實(shí)驗(yàn)方法:1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物野生(Gal-3(+/+))型ICR雄性健康小鼠，10周齡，日本國(guó)立腫瘤研究所提供。galectin-3基因敲出(Gal-3(-/-))型

6、ICR雄性健康小鼠，10周齡，日本富山醫(yī)科藥科大學(xué)生化學(xué)第一研究室提供。 12.CCl4灌胃致小鼠肝損傷10周齡ICR雄性健康小鼠(Gal-3(+/+)型和Gal-3(-/-)型)，分別隨機(jī)分成0、10、24、48、72小時(shí)組飼養(yǎng)，每組l0只。染毒前禁食12小時(shí)，將CCl4與食用橄欖油等重混合制備灌胃液，按8ml/kg體重給小鼠灌胃。灌胃后立即給食正常飼養(yǎng)。 3.小鼠肝組織病理切片制備及觀察將CCl4灌胃后0、10、24

7、、48、72小時(shí)的小鼠乙醚麻醉，心臟取血后斷頭處死，迅速取出肝臟，用生理鹽水將血液洗去，用小剪刀將小鼠肝臟分成兩份。 用小刀將其中一份小鼠肝組織切成1cm×1cm×0.3cm小塊，立即用100ml/L的中性福爾馬林固定32小時(shí)，這些組織小塊在一系列逐級(jí)上升的酒精中脫水，并隨后在二甲苯中清洗，包埋于石蠟中用切片機(jī)切成5μm厚的切片。制備成HE染色肝組織切片。 光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理變化，計(jì)數(shù)正常細(xì)胞核和異常細(xì)胞核，肝組

8、織切片在放大倍數(shù)400倍的顯微鏡下觀察，可以明顯鑒別出正常細(xì)胞核和含有染色體凝聚碎片的異常細(xì)胞核。正常細(xì)胞核和異常細(xì)胞核的數(shù)量是由兩位獨(dú)立的觀察者計(jì)數(shù)，由聯(lián)接在一臺(tái)顯微鏡上的電腦上的運(yùn)行軟件“立體調(diào)查者”統(tǒng)計(jì)正常細(xì)胞核和異常細(xì)胞核數(shù)目。每組抽取10只小鼠，每只小鼠隨機(jī)抽取10個(gè)切片進(jìn)行細(xì)胞核計(jì)數(shù)。每個(gè)切片由軟件隨機(jī)自動(dòng)最優(yōu)化選取選取9個(gè)面積為100μm×100μm的計(jì)數(shù)區(qū)。每組的異常細(xì)胞核的百分率(異常細(xì)胞核的數(shù)目/總細(xì)胞核的數(shù)目×10

9、0％)隨即計(jì)算出來(lái)。用卡方檢驗(yàn)相同時(shí)間組的野生型和Gal-3基因敲出型鼠肝組織切片的異常細(xì)胞核百分率的差異。 4.小鼠肝細(xì)胞組份的分級(jí)分離將另一份肝組織置于小平皿中(4℃，以下操作均在4℃的低溫室里進(jìn)行)，用小剪刀將小鼠肝組織剪成小碎塊，稱(chēng)重后轉(zhuǎn)移到組織勻漿管中，按9ml/g肝組織重量加入0.25M蔗糖緩沖液，經(jīng)電動(dòng)研桿研磨為勻漿。將每只鼠肝的勻漿液經(jīng)紗布過(guò)濾，保存濾液備用。此濾液為肝細(xì)胞研磨液(HO)，將此濾液轉(zhuǎn)移到離心管中，

10、置4℃離心機(jī)中離心，6000g10分鐘，沉淀為細(xì)胞核組份(Nuc)，取上清進(jìn)行(4℃)離心，8000g10分鐘，沉淀為細(xì)胞線粒體組份(Mt)，取上清液進(jìn)行超速離心，4℃，105000g60分鐘，沉淀為細(xì)胞微粒體組份(Mic)，上清液為肝細(xì)胞基質(zhì)組份(Cyt)。將分離的各細(xì)胞組份置-80℃冰箱保存。 5.蛋白印跡法的檢測(cè)及記錄采用BCA蛋白定量檢測(cè)試劑對(duì)小鼠肝細(xì)胞研磨液組份、細(xì)胞核組份、線粒體組份、肝細(xì)胞基質(zhì)組份和微粒體組份進(jìn)行總

11、蛋白定量，按總蛋白均衡各組份上樣體積(5-20μl)，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后在電轉(zhuǎn)移槽中將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用含5％牛奶的TBST室溫封閉1h，將轉(zhuǎn)印膜加入第一抗體室溫孵育1h，除去抗體孵育液，用TBST液洗膜3次，每次5min。將轉(zhuǎn)印膜加入第二抗體室溫孵育1h，除去抗體孵育液，用TBST液洗膜3次，每次10min。加入ECL蛋白印跡檢測(cè)分析試劑，在化學(xué)冷光影像分析儀(LAS-1000plus)中30分鐘化學(xué)

12、發(fā)光反應(yīng)顯影、攝影記錄。將免疫蛋白印跡顯影圖像掃描，利用BandLeaderV3.0圖像分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，單位面積上扣除背景后的平均光密度值(MOD)代表酶含量，用t檢驗(yàn)，比較相同時(shí)間、相同細(xì)胞組份的Gal-3基因敲出型跟野生型鼠的免疫蛋白印跡結(jié)果的差別。 6.血清ALT、AST酶活性檢測(cè)將取出的血液在2000rpm離心10分鐘，分離血清。用InfinityTMALT試劑和InfinityTMAST分別檢測(cè)鼠血清中AL

13、T、AST酶活性。將相同時(shí)間組的Gal-3基因敲出型和野生型鼠的血清ALT及AST活性均值進(jìn)行t檢驗(yàn)。 7.Galectin-3復(fù)合體的分離純化將CCl4灌胃后48小時(shí)野生型鼠肝細(xì)胞勻漿液經(jīng)DE-52柱層析、Hydroxyapatite柱層析、鹽析和脫鹽、SephacrylS-300凝膠層析后分離純化一種分子量為65kDa的Galectin-3復(fù)合體蛋白。 結(jié)論:1.CCl4引起Gal-3(-/-)小鼠肝損傷比野生型小鼠

14、肝損傷出現(xiàn)時(shí)間早、損傷程度嚴(yán)重，Gal-3(-/-)小鼠肝損傷時(shí)，異常細(xì)胞核百分率、ALT、AST均高于野生型小鼠，提示Gal-3可能在CCl4肝損傷過(guò)程中有保護(hù)肝細(xì)胞減緩損傷的作用。 2.野生型小鼠肝損傷時(shí)肝細(xì)胞微粒體中GRP78的表達(dá)明顯高于Gal-3(-/-)小鼠，說(shuō)明Gal-3可能通過(guò)上調(diào)GRP78的表達(dá)參與肝細(xì)胞損傷的修復(fù)作用，是其作用機(jī)制之一。 3.Caspase3、Caspase7與PARP在Gal-3(+