PLKs介導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞周期阻滯和朊病毒清除的機(jī)制研究.pdf

1、朊病毒是一種可感染人和動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的傳染性蛋白質(zhì)，其引起的疾病包括人的克雅氏病、庫(kù)魯病、吉斯曼綜合征、致死性家族失眠癥以及動(dòng)物的羊瘙癢癥、瘋牛病等，死亡率達(dá)100％。目前普遍認(rèn)為其致病原因是具有正常生理結(jié)構(gòu)的朊蛋白PrPC在未知因素誘導(dǎo)下發(fā)生異常折疊轉(zhuǎn)變?yōu)榫叩鞍酌缚剐缘闹虏‰玫鞍譖rPSc。在朊病毒感染的早期階段，異常折疊的PrPSc蛋白可激發(fā)多種應(yīng)激反應(yīng)引起神經(jīng)元的損傷，同時(shí)被感染的神經(jīng)元試圖通過(guò)自噬或凋亡的方式以達(dá)到清除PrPS

2、c的目的;在感染的晚期階段，由于大量的PrPSc蛋白無(wú)法被及時(shí)清除，引起的神經(jīng)毒性造成了一系列的病理學(xué)改變，如神經(jīng)元的死亡、星型膠質(zhì)和小膠質(zhì)細(xì)胞的增生、淀粉樣斑塊沉積和腦組織內(nèi)空泡樣變性等。
　　盡管目前對(duì)朊病毒引起神經(jīng)元死亡的機(jī)制已有一定了解，但其詳細(xì)的機(jī)制尚未闡明。長(zhǎng)期以來(lái)的研究認(rèn)為成熟的神經(jīng)元屬于終末分化的細(xì)胞，處于不可分裂的狀態(tài)，無(wú)法越過(guò)G0期而進(jìn)入細(xì)胞周期。然而近年來(lái)的研究表明在阿爾茲海默癥(Alzheimer's di

3、sease，AD)和帕金森癥(Parkinson's disease，PD)等中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病患者的腦組織切片中檢測(cè)到神經(jīng)元中上調(diào)表達(dá)的細(xì)胞周期蛋白，因此科學(xué)家們提出了中樞神經(jīng)元可在某種因素的誘導(dǎo)下重新進(jìn)入細(xì)胞周期的假說(shuō)，并在AD、PD和朊病毒病的細(xì)胞模型中證實(shí)了這一假說(shuō)。Polo樣激酶(Polo-like kinases，PLKs)是廣泛存在于真核生物中的一類(lèi)絲氨酸/蘇氨酸激酶，對(duì)細(xì)胞周期的各個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)發(fā)揮多種精密的調(diào)控作用，如中

4、心體的復(fù)制、成熟、有絲分裂的進(jìn)入和姐妹染色體的分離等。目前已在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)五種PLK，其中PLK1的上調(diào)和PLK3的下調(diào)表達(dá)與多種惡性腫瘤的發(fā)展及不良預(yù)后相關(guān)。除了在細(xì)胞周期中發(fā)揮作用之外，PLK2/3還參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸可塑性的調(diào)節(jié)。
　　由于朊病毒病中存在神經(jīng)元細(xì)胞周期再進(jìn)入事件，而PLK1/3在細(xì)胞周期G2/M期轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，我們前期的基因芯片轉(zhuǎn)錄譜分析發(fā)現(xiàn)在朊病毒病患者腦組織中PLK1上調(diào)，而PLK3下

5、調(diào)，因此我們建立這樣的假說(shuō):“朊病毒病中PLKs參與調(diào)控神經(jīng)元細(xì)胞周期阻滯”。本研究利用朊病毒感染的細(xì)胞模型和動(dòng)物模型，通過(guò)免疫組織化學(xué)、免疫印跡等技術(shù)探討了PLKs在朊病毒病病程中的變化規(guī)律，分析了其在神經(jīng)元細(xì)胞周期阻滯和清除PrPSc蛋白中的重要作用和機(jī)制，為臨床精準(zhǔn)治療朊病毒病提供實(shí)驗(yàn)室研究基礎(chǔ)。
　　本研究主要分兩大部分:
　　第一部分:朊病毒病中PLK1/3信號(hào)介導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞周期阻滯
　　為了觀察朊病毒病中P

6、LK是否參與神經(jīng)元細(xì)胞周期再進(jìn)入的調(diào)控，我們首先采用蛋白免疫印跡、免疫組化、免疫熒光等方法，檢測(cè)了朊病毒羊瘙癢因子263K感染的倉(cāng)鼠腦組織中PLK等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的組織分布和表達(dá)水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn):與正常腦組織相比，感染263K腦組織的皮質(zhì)和小腦區(qū)域PLK1和PLK3的染色變化顯著，在感染終末期的腦組織勻漿中PLK1的表達(dá)明顯升高，而PLK3的表達(dá)明顯降低，甚至消失。動(dòng)態(tài)研究發(fā)現(xiàn)在倉(cāng)鼠朊病毒病的潛伏期PLK1/3的表達(dá)即發(fā)生了變化。

7、激光共聚焦分析顯示PLK1/3與皮層灰質(zhì)區(qū)的神經(jīng)元標(biāo)志物Neun存在明顯的共定位，而與膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物GFAP不發(fā)生共定位，這提示PLK1/3主要分布在神經(jīng)元中，明確了PLK1/3的表達(dá)變化發(fā)生在神經(jīng)細(xì)胞中。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PLK1的下游蛋白Cyclin B1的表達(dá)也明顯上調(diào)，而PLK3的下游蛋白Cdc25C和P-Cdc25C（ser-216）卻表達(dá)下調(diào)，這些變化可促使神經(jīng)元再次進(jìn)入細(xì)胞周期，并由G2期向M期轉(zhuǎn)化，然而M期蛋白P-Hist

8、one H3的表達(dá)卻無(wú)明顯變化，這一結(jié)果說(shuō)明了朊病毒病中PLK3調(diào)控神經(jīng)元再次進(jìn)入細(xì)胞周期，但并不能完成整個(gè)細(xì)胞周期，從而引起細(xì)胞周期阻滯引發(fā)神經(jīng)元凋亡，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的丟失。在穩(wěn)定感染朊病毒的SMB-S15細(xì)胞系中我們觀察到類(lèi)似于朊病毒病倉(cāng)鼠模型中PLK1/3的變化。為了排除細(xì)胞系永生化狀態(tài)對(duì)研究細(xì)胞周期的影響，接著我們又采用PrPSc類(lèi)似肽106-126處理了小鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞，結(jié)果與上述研究相一致。
　　第二部分:PLK3

9、介導(dǎo)對(duì)異常朊蛋白的降解作用
　　為進(jìn)一步闡明PLK3表達(dá)下調(diào)與朊病毒病的關(guān)系，我們通過(guò)GST Pull-down和免疫共沉淀的方法，在體內(nèi)和體外證實(shí)了PLK3和PrP蛋白的相互作用關(guān)系，不僅全長(zhǎng)的PLK3可以與PrP蛋白發(fā)生相互作用，PLK3蛋白N端的激酶區(qū)(kinasedomain，KD)和C端的Polo盒子區(qū)(Polo-box domain，PBD)都能與PrPSc蛋白發(fā)生相互作用。為了更深入地解析PLK3與PrP蛋白之間發(fā)生

10、相互作用的生物學(xué)意義，我們將不同濃度的PLK3蛋白和野生型及突變體PrP蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高濃度的PLK3可以降解突變體PrP蛋白，但對(duì)野生型PrP蛋白的表達(dá)影響不大。PLK3的這種降解作用似乎依賴(lài)于PLK3蛋白的KD區(qū)，而與PBD區(qū)無(wú)關(guān)。進(jìn)一步利用RNAi技術(shù)敲低PLK3的表達(dá)可以明顯增加異常PrP突變體蛋白的水平。利用蛋白酶體和自噬溶酶體抑制劑處理后發(fā)現(xiàn)，蛋白酶體抑制劑和巨自噬抑制劑對(duì)PLK3介導(dǎo)的PrP突

11、變體的降解作用無(wú)明顯影響，而溶酶體途徑抑制劑能明顯阻斷PLK3對(duì)PrP突變體的降解作用，提示該降解作用依賴(lài)于溶酶體途徑。我們?cè)诜€(wěn)定感染朊病毒的SMB-S15細(xì)胞系中也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的現(xiàn)象，即轉(zhuǎn)染PLK3質(zhì)粒后，上調(diào)PLK3的表達(dá)可以顯著降低異常PrPSc蛋白的水平，而對(duì)正常PrPC蛋白的表達(dá)水平影響不大。
　　綜上所述，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，終末分化的中樞神經(jīng)細(xì)胞在受到朊病毒病感染因子的刺激下，迅速驅(qū)使細(xì)胞再次進(jìn)入細(xì)胞周期以應(yīng)對(duì)感染引起

12、的應(yīng)激壓力，但神經(jīng)細(xì)胞由于缺乏完成有絲分裂的相關(guān)調(diào)控元件，導(dǎo)致細(xì)胞周期被阻滯在M期，致使細(xì)胞周期再啟動(dòng)的失敗，我們推測(cè)這種異常的細(xì)胞周期再進(jìn)入事件啟動(dòng)了凋亡程序，最終導(dǎo)致了神經(jīng)細(xì)胞的死亡。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)PLK3蛋白可通過(guò)其N(xiāo)端的KD區(qū)介導(dǎo)對(duì)朊病毒蛋白的降解。因此，如果在朊病毒感染的早期通過(guò)某種干預(yù)手段誘導(dǎo)PLK3的表達(dá)，有可能防止異常PrPSc蛋白的聚集并阻止細(xì)胞周期的再進(jìn)入，我們的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果為朊病毒病的精準(zhǔn)靶點(diǎn)治療提供新的線(xiàn)索和思路，