慢病毒介導siRNA沉默NMⅡ在體外培養(yǎng)的大鼠DRGs神經(jīng)元細胞中作用的實驗研究.pdf

1、目的：
　　通過構(gòu)建慢病毒載體，探究體外沉默NMⅡ基因表達對大鼠DRGs神經(jīng)元細胞的影響。
　　方法：
　　針對NMⅡ基因構(gòu)建不同干擾效率的大鼠NMⅡ siRNA表達質(zhì)粒，分別為空白對照組、空質(zhì)粒組、siRNA1組、siRNA2組及siRNA3組，并使用慢病毒包裝系統(tǒng)，轉(zhuǎn)染至大鼠DRGs神經(jīng)元細胞中。（1）通過Rt-PCR及Western Blot技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后神經(jīng)元細胞內(nèi)NMⅡ基因mRNA及其蛋白的表達情況，探究體外

2、基因沉默NMⅡ的效率；（2）采用掃描電子顯微鏡技術(shù)，直接觀察NMⅡ基因沉默后神經(jīng)元生長錐的結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果：
　　成功構(gòu)建了大鼠含NMⅡ siRNA的慢病毒顆粒。各組NMⅡ siRNA均能夠順利轉(zhuǎn)染入神經(jīng)元細胞。結(jié)果表明，siRNA3組體外沉默大鼠DRGs細胞NMⅡ基因的效率達80％以上；siRNA1組沉默效率約為30%；siRNA2組的沉默效率約為60%。RT-PCR結(jié)果顯示，siRNA3組中大鼠神經(jīng)元細胞的NMⅡ mRN

3、A的表達量明顯低于其它4組，差異具有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）；Western blot的結(jié)果表明，siRNA3組中大鼠DRGs細胞的NMⅡ蛋白的表達量較其它4組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）；掃描電鏡結(jié)果顯示：在空白對照組及空質(zhì)粒組中，神經(jīng)元細胞內(nèi)線粒體形態(tài)完整，髓鞘排列整齊，細胞間橋粒清晰可見，軸突中的微管結(jié)構(gòu)排列整齊，可觀察到較為完整的生長錐結(jié)構(gòu)。而在siRNA3組中，可見神經(jīng)元軸突內(nèi)的微管結(jié)構(gòu)排列紊亂，大部分細胞溶