多巴胺對大鼠體外培養(yǎng)視皮層神經(jīng)元γ-氨基丁酸激活電流作用的研究.pdf

1、第一章探求視皮層神經(jīng)元的最佳分離和培養(yǎng)方法 目的:通過原代培養(yǎng)新生大鼠視皮層神經(jīng)元，探求視皮層神經(jīng)元的最佳分離和培養(yǎng)方法，提高原代培養(yǎng)神經(jīng)元的純度及活性，為視皮層相關(guān)性眼病的臨床基礎(chǔ)研究提供實驗?zāi)Ｐ汀?方法:取出生后1～3d清潔級SD大鼠，定位視皮層，以酶消化法分離視皮層神經(jīng)元，應(yīng)用含10％新生牛血清、10％F-12 NutrientMixtures的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行接種培養(yǎng)，含2％B-27 Serum-Free Su

2、pplements的Neurobasal Medium進(jìn)行維持培養(yǎng)。利用尼氏染色進(jìn)行神經(jīng)元鑒定。 結(jié)果:接種1h后大部分細(xì)胞已貼壁。2～3h后見少數(shù)細(xì)胞長出較短的突起。24h后長出突起的神經(jīng)元數(shù)目逐漸增多，突起長度增加。10d后神經(jīng)元突起長度可達(dá)自身胞體直徑的10倍以上，并形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。15～16d后神經(jīng)元開始發(fā)生退化。鏡下非神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)與神經(jīng)元存在差別并易區(qū)分。6d后非神經(jīng)元細(xì)胞逐漸減少。神經(jīng)元經(jīng)尼氏染色后胞漿呈藍(lán)紫色

3、，尼氏小體顆粒狀，結(jié)構(gòu)清晰。非神經(jīng)元細(xì)胞胞漿基本不著色，胞核淡紫色圓形，核仁清晰可辨。神經(jīng)元比例為40％～50％。 結(jié)論: 1.培養(yǎng)視皮層神經(jīng)元生長良好，活性佳，易與非神經(jīng)元細(xì)胞鑒別。 2.尼氏染色顯示培養(yǎng)神經(jīng)元比例約為40％～50％。 第二章培養(yǎng)大鼠視皮層神經(jīng)元γ-氨基丁酸激活電流的特點 目的:探討培養(yǎng)大鼠視皮層神經(jīng)元γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid，GABA)-激活

4、電流的特點。 方法:選擇培養(yǎng)第11～14d形態(tài)典型、狀態(tài)良好的視皮層神經(jīng)元，應(yīng)用膜片鉗技術(shù)以全細(xì)胞模式記錄其GABA-激活電流(IGABA)。 結(jié)果: 1.大部分受檢細(xì)胞(85.42％，41/48)對GABA敏感。同一細(xì)胞IGABA幅值與GABA濃度呈劑量依賴關(guān)系：隨濃度增大IGABA幅值逐漸增大。不同細(xì)胞上予以相同濃度的GABA，IGABA幅值不同。 2.IGASA具有明顯的去敏感現(xiàn)象，應(yīng)用雙刺激法檢測

5、IGABA的去敏感時程，發(fā)現(xiàn)GABAA受體的去敏感恢復(fù)時間為5min。 3.IGABA可被GABAA受體的選擇性拮抗劑荷包牡丹堿阻斷，可被特異性GABAA受體激動劑蠅覃醇(Muscimol)模擬。 4.IGABA反轉(zhuǎn)電位為0mV左右，接近CI-平衡電位。 5.IGABA幅值穩(wěn)定，比較各時間點(0～30min)測得的變化率，差異無顯著性。將各時間點的結(jié)果總和得到IGABA平均變化率為4.51±3.02％。

6、結(jié)論: 1.大部分培養(yǎng)大鼠視皮層神經(jīng)元對GABA敏感。 2.IGABA具有劑量依賴性及明顯的去敏感現(xiàn)象。 3.IGABA幅值穩(wěn)定，平均變化率為4.51±3.02％。 第三章多巴胺對培養(yǎng)大鼠視皮層神經(jīng)元GABA-激活電流的作用 目的:探討多巴胺(Dopamine，DA)對培養(yǎng)大鼠視皮層神經(jīng)元GABA-激活電流的作用。 方法:選擇培養(yǎng)第11-14d形態(tài)典型、狀態(tài)良好的視皮層神經(jīng)元，應(yīng)用膜片鉗技

7、術(shù)以全細(xì)胞模式記錄IGABA。在不同時間點于細(xì)胞外液中分別加入不同濃度的DA、D1受體選擇性激動劑SKF38393、D2受體選擇性激動劑Quinpirole，聯(lián)合應(yīng)用SKF38393與D1受體拮抗劑SCH23390、SKF38393與Quinpirole觀察IGABA的變化。 結(jié)果: 1.IGABA對DA存在劑量及時間依賴效應(yīng)。預(yù)加DA可減小IGABA，加入10μM～500μMDA后，ICABA的變化率與對照組相比差異有

8、顯著性，其中50μM的劑量產(chǎn)生的作用最為顯著。DA作用2～6min后，IGABA的變化率與對照組相比差異有顯著性。抑制作用一般在預(yù)加4min后達(dá)到穩(wěn)定。 2.IGABA對D1受體選擇性激動劑SKF38393存在劑量及時間依賴效應(yīng)。預(yù)加SKF38393可減小IGABA，加入1μM～100μM SKF38393后，IGABA的變化率與對照組相比差異有顯著性，劑量超過10μM后作用基本趨于穩(wěn)定。10μM SKF38393作用3～6mi

9、n后與對照組相比差異有顯著性。抑制作用一般在預(yù)加4min后達(dá)到穩(wěn)定。應(yīng)用D1受體拮抗劑SCH23390(10μM)可顯著減小SKF38393(10μM)對IGABA的抑制作用，差異有顯著性。 3.單獨應(yīng)用10μM、100μM、1mM D2受體選擇性激動劑Quinpirole 5min、10min后對IGABA無明顯作用。 4.與單獨應(yīng)用SKF38393(10μM)相比，聯(lián)合應(yīng)用SKF38393(10μM)及Quinpir

10、ole(10μM)4～6min后對IGABA的抑制作用減弱，在5min組差異有顯著性。 結(jié)論: 1.IGABA可被DA、D1受體選擇性激動劑SKF38393抑制，其抑制程度與二者存在劑量及時間依賴性。D1受體拮抗劑SCH23390可顯著減小SKF38393對IGABA的抑制作用。 2.單獨應(yīng)用D2受體選擇性激動劑Quinpirole對IGABA無明顯作用。 3.SKF38393及Quinpirole聯(lián)合應(yīng)