Rac1基因?qū)θ死w維肉瘤HT1080細(xì)胞侵襲Ⅰ型膠原蛋白屏障的影響及機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的：在原發(fā)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中，細(xì)胞必須降解并穿過(guò)由細(xì)胞外基質(zhì)組成的組織屏障，然后通過(guò)缺損基質(zhì)進(jìn)行侵襲性生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。由小GTP酶Rho家族調(diào)控的肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)在細(xì)胞遷移過(guò)程中扮演了一個(gè)重要角色。細(xì)胞遷移的起始特征是肌動(dòng)蛋白在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)方向前沿聚合，并延伸為薄片狀的偽足。已有研究證實(shí)，Rho家族成員Rac1具有調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)絲在細(xì)胞外周聚集形成板層足板，同時(shí)參與了細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移的過(guò)程。最近的研究證實(shí)Rac1對(duì)細(xì)胞在Ⅰ型膠原

2、基質(zhì)中侵襲有直接調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了活性RacI基因的非侵襲性哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞T47D可誘導(dǎo)其產(chǎn)生侵襲I型膠原的能力。同樣，銜接蛋白p130Crk相關(guān)底物(CAS)1/c-Crk Ⅱ(Crk)的過(guò)表達(dá)也可誘導(dǎo)在三維(3D)膠原基質(zhì)中培養(yǎng)的Rac1依賴(lài)性COS-7細(xì)胞的侵襲。但是，有關(guān)Rac1促進(jìn)細(xì)胞侵襲細(xì)胞外基質(zhì)膠原屏障過(guò)程中膠原蛋白降解的機(jī)制仍不明確。 惡性腫瘤侵襲性生長(zhǎng)與腫瘤周?chē)|(zhì)蛋白降解及重塑(remodeling

3、)是高度協(xié)調(diào)發(fā)生的事件。研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)可在多種癌組織中表達(dá)，且其表達(dá)的強(qiáng)弱與腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。細(xì)胞表面的蛋白降解活性可大大提高腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移效能，基質(zhì)金屬蛋白酶2 (MMP2、Ⅳ型膠原酶、明膠酶A)是一種與細(xì)胞表面相連的可降解Ⅰ型膠原蛋白的MMP，其活化與膜型基質(zhì)金屬蛋白酶(MT-MMP)及金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)有密切關(guān)系。 我們研究的目的是為了進(jìn)一步驗(yàn)證Rac1基因的表達(dá)對(duì)腫

4、瘤細(xì)胞侵襲膠原蛋白基質(zhì)的影響，并探討Rac調(diào)控的腫瘤細(xì)胞侵襲Ⅰ型膠原蛋白組織屏障是否與啟動(dòng)MT1-MMP/MMP2蛋白降解級(jí)連反應(yīng)有關(guān)。 方法：我們首先在體外研究外源Rac1基因表達(dá)對(duì)人纖維肉瘤HT1080細(xì)胞(以下簡(jiǎn)稱(chēng)HT1080細(xì)胞)侵襲膠原屏障的影響，將顯性負(fù)調(diào)控突變體Rac1V12N17(HN)、結(jié)構(gòu)激活型突變體Rac1V12(HV)或空載體(HW)轉(zhuǎn)染HT1080細(xì)胞(以下分別簡(jiǎn)稱(chēng)HN、HV、HW細(xì)胞)，用G418篩選

5、轉(zhuǎn)染克隆，并擴(kuò)增培養(yǎng)。用Western印跡分析檢測(cè)外源性Rac1基因表達(dá)，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞在含膠原蛋白凝膠的3D基質(zhì)中培養(yǎng)，用得克薩斯紅結(jié)合的鬼筆環(huán)肽染色顯示細(xì)胞肌動(dòng)蛋白。在用膠原蛋白凝膠覆蓋濾膜的Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞穿膜侵襲實(shí)驗(yàn)，并觀(guān)察二種蛋白酶抑制劑對(duì)上述細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)的影響。 然后，對(duì)3D膠原蛋白和纖維蛋白細(xì)胞培養(yǎng)體系中的細(xì)胞裂解液和培養(yǎng)液，采用明膠和膠原蛋白酶譜分析法觀(guān)察Rac1對(duì)多種基質(zhì)金屬蛋白酶活化的影響;采用Wes

6、tern印跡法觀(guān)察Rac1對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)表達(dá)的影響。同時(shí)，我們還觀(guān)察了不同蛋白酶抑制劑對(duì)Rac1介導(dǎo)的MMP2活化的影響。 我們采用Northern印跡法和Western印跡法檢測(cè)在3D基質(zhì)培養(yǎng)體系中，由于外源突變Rac1基因?qū)T1080細(xì)胞的MT1-MMP轉(zhuǎn)錄、表達(dá)及MT1-MMP的降解片段的影響；采用膠原蛋白降解實(shí)驗(yàn)觀(guān)察轉(zhuǎn)染后的HT1080細(xì)胞對(duì)膠原蛋白薄膜的降解能力的變化；采用穿膜(transwell)實(shí)

7、驗(yàn)觀(guān)察了特異性MMP2抑制劑對(duì)Rac1介導(dǎo)的HT1080細(xì)胞侵襲膠原蛋白屏障的影響。 結(jié)果：對(duì)分別轉(zhuǎn)染HN突變體、HV突變體和HW空載體的HT1080細(xì)胞，用Western印跡法檢測(cè)Rac1的表達(dá)。結(jié)果顯示，HN和HV細(xì)胞均有內(nèi)源性和外源性Racl表達(dá)，HW細(xì)胞僅見(jiàn)內(nèi)源性Rac1表達(dá)。熒光顯微鏡觀(guān)察，在3D膠原蛋白凝膠中培養(yǎng)的不同轉(zhuǎn)染細(xì)胞呈現(xiàn)明顯不同的細(xì)胞形態(tài)和排列結(jié)構(gòu)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)顯示HV細(xì)胞侵襲膠原屏障的能力大于HW細(xì)胞，而

8、后者又強(qiáng)于HN細(xì)胞，這種差別在應(yīng)用廣譜MMPs抑制劑后消失，抑肽酶則無(wú)此影響。 在3D膠原蛋白凝膠培養(yǎng)體系中，與HW細(xì)胞比較，HV細(xì)胞的裂解液和培養(yǎng)液中均可觀(guān)察到MMP2活化增強(qiáng)，而HN細(xì)胞則呈相反改變。在3D纖維蛋白凝膠培養(yǎng)體系中，HW和HN細(xì)胞裂解液和培養(yǎng)液中均未見(jiàn)活化的MMP2:而HV細(xì)胞則可觀(guān)察到活化的MMP2。 廣譜MMPs抑制劑SC68180可消除HV細(xì)胞裂解液和培養(yǎng)液中MMP2活化的增強(qiáng)，而另一種蛋白酶抑制

9、劑，抑肽酶，則沒(méi)有這種抑制效應(yīng)。在3D膠原蛋白基質(zhì)中，與HW細(xì)胞比較，HV細(xì)胞的MT1-MMP轉(zhuǎn)錄水平，以及蛋白表達(dá)和降解明顯升高，而HN細(xì)胞三者均呈現(xiàn)下降改變。 與HW細(xì)胞比較，HV細(xì)胞降解膠原蛋白薄膜的能力明顯增強(qiáng)；相反，HN細(xì)胞降解能力則減弱。HV細(xì)胞的MMP2活化增強(qiáng)可被其特異性抑制劑CTD所減弱，這種減弱效應(yīng)呈濃度依賴(lài)性。膠原蛋白屏障侵襲實(shí)驗(yàn)也表明，TIMP2、FI(佛林蛋白酶抑制劑)和MMP2抑制劑CTD可顯著減弱結(jié)