Rac1蛋白在呼吸機相關(guān)性肺損傷中的作用機制研究.pdf

1、目的:
　　探討Rac1蛋白在呼吸機相關(guān)性肺損傷發(fā)病機制中的作用。
　　方法:
　　將30只健康潔凈級SD大鼠（雌雄各半）隨機分為自主呼吸組(A組)、正常潮氣量(VT)組（B組，VT=6ml·kg-1）和大VT組（C組，VT=40ml·kg-1），每組10只。各組大鼠經(jīng)腹腔注射麻醉后行氣管切開插管術(shù)。其中A組保持大鼠自主呼吸，B組按6ml·kg-1的潮氣量行機械通氣，C組則按40ml·kg-1的潮氣量給予機械通氣，24

2、0min后經(jīng)心臟穿刺放血處死大鼠。分別收集各組大鼠的血清、支氣管肺泡灌洗液(BALF)及肺組織標本，利用微量電子秤測定肺組織的濕干比重(W/D);通過透射電子顯微鏡(TEM)觀察肺泡上皮細胞的超微結(jié)構(gòu);采用蘇木精-伊紅染色(HE)及光學顯微鏡觀察大鼠肺組織病理變化;使用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定BALF與血清中白介素-1β(IL-1β)、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、髓過氧化物酶(MPO)及巨噬細胞炎性蛋

3、白-2(MIP-2)含量變化;通過免疫組織化學法檢測Rac1、磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(p-ERK)及肌動蛋白(F-actin)在肺組織中的表達;采用蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot)檢測Rac1、p-ERK及F-actin在各組大鼠肺組織中的表達差異;利用免疫熒光技術(shù)(IFT)在共聚焦顯微鏡下觀察肺組織中Rac1及F-actin的表達情況;應用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測Rac1、ERK及F-acti

4、n的基因mRNA的表達水平。
　　結(jié)果:
　　與A組及B組比較，C組大鼠肺組織的W/D比值有顯著增高（6.64±0.88比1.79±0.36、4.76±0.73，P＜0.05）。光學顯微鏡觀察HE染色顯示，A組肺組織無明顯病理學改變;B組肺組織有輕微水腫及少量炎性細胞浸潤;C組肺組織明顯水腫，肺間隔增寬，肺泡充血，伴有大量炎性細胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂。C組肺組織病理學評分明顯高于A組和B組（評分比:12.00±2.00比6.0

5、0±1.51、8.50±0.53，均P＜0.05）。TEM檢測結(jié)果提示，A組肺泡上皮細胞超微結(jié)構(gòu)無明顯改變;B組肺泡上皮細胞中板層小體等細胞器減少，細胞膜絨毛分布欠均勻;C組肺泡上皮細胞形態(tài)不規(guī)則，核固縮明顯，胞質(zhì)中板層小體及線粒體等細胞器數(shù)量明顯減少且分布不均。ELISA結(jié)果顯示，與A組及B組比較，C組大鼠血清及BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α、MPO、MIP-2均有明顯升高[BALF中IL-1β（ng/L）:121.51±

6、25.62比24.03±7.46、63.8±18.10，IL-6(ng/L):136.65±32.65比31.35±10.51、52.23±6.95，TNF-α（ng/L）:97.96±14.75比10.12±2.58、46.45±16.89，MPO(ng/L):0.80±0.31比0.08±0.04、0.24±0.09，MIP-2(ng/L):144.41±28.86比41.22±20.65、79.23±8.85;血清中IL-1β(n

7、g/L):104.18±15.10比20.31±8.25、57.35±15.97，IL-6（ng/L）:46.57±11.52比22.65±7.49、44.20±13.27，TNF-α（ng/L）:39.41±6.53比5.37±1.87、19.25±4.55，MPO(ng/L):0.66±0.24比0.06±0.03、0.23±0.07，MIP-2(ng/L):109.20±25.78比22.77±8.37、57.32±24.51]，

8、組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。免疫組織化學法檢測顯示，A組大鼠肺組織僅有極少量的p-ERK、Rac1和F-actin表達陽性;B組陽性表達有所增加;C組中p-ERK、Rac1和F-actin的蛋白陽性表達均有明顯增加。Western Blot結(jié)果亦提示:C組大鼠肺組織中p-ERK、Rac1和F-actin的蛋白表達明顯高于A組和B組（p-ERK蛋白灰度值比:1.15±0.36比0.61±0.23、0.88±0.22，Rac1

9、蛋白灰度值比:0.91±0.16比0.48±0.11、0.55±0.10，F(xiàn)-actin蛋白灰度值比:0.70±0.09比0.49±0.08、0.55±0.04，組間比較P＜0.05）。共聚焦顯微鏡下IFT顯示，C組肺組織中Rac1和F-actin蛋白廣泛分布于細胞膜骨架及細胞質(zhì)中，較A組和B組更為顯著。而qRT-PCR檢測ERK和Rac1的mRNA水平顯示，C組較A組及B組的比值亦更高[ERK mRNA(2-△△Ct):8.23±2.