Rac1蛋白在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其促進(jìn)膠質(zhì)愛情的代價(jià)瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)機(jī)制的研究.pdf

1、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma multiforme, GBM）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見、侵襲性最強(qiáng)的惡性膠質(zhì)瘤，屬人類難治性和預(yù)后極差的腫瘤之一。盡管采用規(guī)范的標(biāo)準(zhǔn)化治療，但膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后改善甚微。即使腫瘤實(shí)現(xiàn)影像學(xué)全切，但膠質(zhì)母細(xì)胞瘤術(shù)后常常復(fù)發(fā)于腫瘤周圍2cm范圍[1-3]。臨床和病理學(xué)證據(jù)表明膠質(zhì)瘤細(xì)胞常常沿著細(xì)長的解剖結(jié)構(gòu)浸潤播散，如腦白質(zhì)纖維束、微血管和無髓鞘軸突[4]。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤侵襲遷移的特性是其不良預(yù)后的主要

2、原因。因此，越來越多的人意識(shí)到靶向抑制調(diào)控膠質(zhì)瘤侵襲遷移的分子將為膠質(zhì)瘤的治療提供新方法。
　　膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移侵襲是一個(gè)完整和復(fù)雜的多步驟過程，其發(fā)生侵襲需要4個(gè)基本步驟，包括①.腫瘤細(xì)胞脫離腫瘤實(shí)體；②.與細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）的黏附；③.在基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)等作用下降解ECM；④.細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和收縮。在這些步驟中，最為關(guān)鍵的環(huán)

3、節(jié)為細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)。作為重要的信號(hào)分子，肌動(dòng)蛋白骨架及其調(diào)控蛋白在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮了重要作用[5,6]。Rac1為Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1的簡稱，其基因全長29 kb，包含7個(gè)外顯子，位于人染色體7p22，參與Ras基因的惡性轉(zhuǎn)型。Rac1作為Rho家族成員之一，存在Rac1-GDP（失活狀態(tài)）和Rac1-GTP（激活狀態(tài)）兩種形式,是細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵分子。Rac1作為分子開關(guān)參與調(diào)節(jié)一系列的細(xì)胞功能,包括細(xì)胞增殖

4、、凋亡，腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移等。片狀偽足的形成和黏著斑的周轉(zhuǎn)作為細(xì)胞遷移的兩個(gè)關(guān)鍵步驟，在細(xì)胞的遷移中發(fā)揮重要作用。Rac1不僅參與細(xì)胞片狀偽足的形成，而且參與黏著斑的周轉(zhuǎn)調(diào)節(jié)，被認(rèn)為是調(diào)控腫瘤細(xì)胞侵襲遷移的關(guān)鍵因子。相關(guān)研究表明，Rac1在上皮性卵巢癌、胃癌、肝細(xì)胞癌等腫瘤中過表達(dá)并與腫瘤惡性進(jìn)展密切相關(guān)[7-9]。
　　本課題主要研究Rac1在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)機(jī)制的研究，包括三個(gè)部分：
　　1.人膠質(zhì)瘤

5、組織中Rac1的表達(dá)。為研究膠質(zhì)瘤中Rac1的表達(dá)及其與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)的相關(guān)性，40例各級(jí)別的膠質(zhì)瘤標(biāo)本以及8例對(duì)照腦組織被用于實(shí)驗(yàn)研究。首先，我們運(yùn)用免疫組化檢測Rac1在不同標(biāo)本中的表達(dá)，結(jié)果證實(shí)，Rac1在對(duì)照腦組織中不表達(dá)，而在膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中其染色強(qiáng)度隨著腫瘤級(jí)別的升高而增強(qiáng)(F=105.225，P=0.000)。
　　接下來，蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)被用于進(jìn)一步半定量評(píng)估 Rac1在各組織中的表達(dá)，結(jié)果為對(duì)照腦組織中Rac1的

6、表達(dá)量為0.093±0.025(n=8)，而WHO II、WHO III和WHO IV級(jí)膠質(zhì)瘤標(biāo)本中Rac1表達(dá)量分別為0.22±0.031(n=8)，0.38±0.031(n=12)，0.61±0.025(n=20)。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果表明，相比于對(duì)照腦組織，Rac1在膠質(zhì)瘤中表達(dá)量升高（P<0.01），且與膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)呈正相關(guān)（r=0.92, P=0.012）。
　　2. Rac1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲中的作用。我們使用Rac1的

7、特異性的小分子抑制劑NSC23766下調(diào)Rac1的活性，探討Rac1對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲遷移的影響。U251和 SNB19細(xì)胞系用于體外實(shí)驗(yàn)研究,實(shí)驗(yàn)分為2組，即 control組和NSC23766處理組。GST pull-down實(shí)驗(yàn)檢測Rac1活性，MTT實(shí)驗(yàn)檢測NSC23766對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞活性的影響；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)分別用于檢測細(xì)胞的侵襲和遷移能力。結(jié)果：Rac1的活性被明顯抑制（P<0.01），抑制Rac1的活性

8、后膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移侵襲能力明顯下降（P<0.01）。
　　3. Rac1促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲的可能機(jī)制。為探究Rac1促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的機(jī)制，Rac1的小分子抑制劑NSC23766和Rac1特異性的小干擾RNA兩種方法被用于體外實(shí)驗(yàn)研究。細(xì)胞免疫熒光觀察細(xì)胞形態(tài)的變化及 Rac1與 LIMK1在細(xì)胞內(nèi)的定位。Western blotting驗(yàn)證control、siRNA-NC和Rac1siRNA組Rac1的表達(dá)情況。Western

9、 blotting檢測不同處理組P-LIMK1（Thr508）、LIMK1、MMP-2和MMP-9的表達(dá)變化。劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)control、Rac1siRNA和 LIMK1siRNA組細(xì)胞遷移、侵襲能力的變化。結(jié)果：與 control組相比， NSC23766處理組細(xì)胞片狀偽足明顯變小甚至不伸展，此外，NSC23766抑制黏著斑的周轉(zhuǎn)，抑制 LIMK1的磷酸化（P<0.01）。Western blotting結(jié)

10、果顯示， Rac1siRNA能明顯下調(diào)Rac1蛋白的表達(dá)。相應(yīng)地，沉默Rac1的表達(dá)可得到相似的結(jié)果。免疫熒光結(jié)果顯示Rac1與LIMK1共定位于細(xì)胞前緣的片狀偽足處。抑制Rac1的活性后MMP-2、MMP-9的表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.01）。與control組相比，Rac1siRNA與LIMK1siRNA組細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯下降（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.與對(duì)照腦組織相比，Rac1在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)明顯升高