骨橋蛋白和Cdc20對人骨肉瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移及化療敏感性的影響.pdf

1、骨肉瘤是常見的一種骨惡性腫瘤，患者一般是20歲以下的青少年或兒童，其較早就可遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后十分不理想。隨著新輔助化療技術(shù)在骨肉瘤治療中的應(yīng)用，顯著提高了患者的生存率，但在手術(shù)后2～3年內(nèi)仍有將近33％的病人因肺轉(zhuǎn)移而死。因此，探索骨肉瘤轉(zhuǎn)移機(jī)理并設(shè)計出相對應(yīng)的新的治療方案，可從根本上改進(jìn)骨肉瘤的預(yù)后狀況。
　　目前，隨著人們對于骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)與腫瘤轉(zhuǎn)移之間關(guān)系的深入研究，人們認(rèn)為骨橋蛋白(Osteopo

2、ntin，OPN)的確調(diào)控著腫瘤轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤組織中OPN的表達(dá)量均升高，而其表達(dá)的增高是腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要因素，OPN可能是腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和預(yù)后的預(yù)測因子。同時，針對OPN或其受體的干預(yù)，成為防治腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在治療靶點。近年來，人們較多關(guān)注OPN在上皮源性惡性腫瘤組織中的表達(dá)，而忽略了其在骨肉瘤中的相關(guān)作用機(jī)制。關(guān)于OPN在骨肉瘤轉(zhuǎn)移中作用，以及利用抗OPN特異性抗體治療骨肉瘤轉(zhuǎn)移的實驗研究尚未見報道。本研究探索了骨肉

3、瘤中OPN的表達(dá)情況，并闡明了其與骨肉瘤細(xì)胞遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性。并以體外建系的人骨肉瘤MG-63細(xì)胞系為模型，研究抗OPN特異性抗體對骨肉瘤高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系侵襲轉(zhuǎn)移生物學(xué)行為的影響。通過抗OPN特異性抗體聯(lián)合化療藥物作用于骨肉瘤MG-63細(xì)胞系，驗證抗OPN特異性抗體治療骨肉瘤的有效性及協(xié)同化療藥作用的可能性。
　　最近研究報道顯示CDC20(cell division cycle20homologue)在許多腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮

4、重要的致癌作用，在人類多種腫瘤組織和細(xì)胞株中，都發(fā)現(xiàn)Cdc20的異常高表達(dá)，包括胰腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、肺癌、乳腺癌等，Cdc20的高表達(dá)與臨床病理指標(biāo)具有相關(guān)性。但是在骨肉瘤中的作用和機(jī)制不是很清楚。
　　目的:
　　采用轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達(dá)Cdc20和敲除Cdc20后，我們檢測了骨肉瘤細(xì)胞株的生長，周期，凋亡，侵襲和遷移，從而推測Cdc20可能是骨肉瘤治療的一個有效靶點。
　　方法:
　　1、以骨肉瘤和骨軟骨瘤為研究

5、對象，應(yīng)用免疫組化S-P法測定OPN的表達(dá)水平，單因素分析OPN的表達(dá)水平與骨肉瘤臨床病例特征之間的關(guān)系，在分析骨肉瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時，我們采用多因素回歸分析模型的方法。利用RT-PCR技術(shù)分別檢測了骨肉瘤組織與正常骨組織標(biāo)本中其mRNA表達(dá)水平，并分析OPN在不同組內(nèi)表達(dá)水平的差異。
　　2、以人骨肉瘤MG-63細(xì)胞系為研究對象，抗OPN特異性抗體作用于MG-63細(xì)胞系，采用Western blot以及RT-PCR等分子生物學(xué)檢測

6、方法分別檢測抗體干擾前后OPN在mRNA和蛋白表達(dá)水平上的變化;MTT法檢測MG-63細(xì)胞在OPN有無干擾時的增殖變化;通過量效曲線及時效曲線分析其生長抑制作用;平板克隆形成實驗檢測細(xì)胞克隆形成能力;通過細(xì)胞劃痕實驗和體外侵襲實驗檢測其對細(xì)胞遷徙和侵襲能力的影響。
　　3、選用MTX、ADM、DDP、IFO、VP16、紫杉醇6種藥物，應(yīng)用抗OPN特異性抗體與化療藥物聯(lián)合作用于骨肉瘤MG-63細(xì)胞株，加入不同濃度梯度化療藥物，MTT

7、方法檢測藥物處理0、24、48以及72小時后的吸光值。分析抗OPN特異性抗體治療骨肉瘤的有效性及與化療藥物的協(xié)同作用。
　　4、以人骨肉瘤MG-63和U2OS細(xì)胞系為研究對象，采用Western blot法檢測干擾前后Cdc20蛋白表達(dá)水平的變化;CTG法檢測骨肉瘤細(xì)胞在Cdc20有無干擾時的增殖變化;通過流式細(xì)胞儀方法檢測細(xì)胞凋亡和周期的改變;通過細(xì)胞劃痕實驗和體外侵襲實驗檢測Cdc20其對細(xì)胞遷徙和侵襲能力的影響。
　　

8、5、統(tǒng)計學(xué)分析:用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包分析數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)以±s表示，用x2檢驗評估計數(shù)資料，用成組比較t檢驗評估計量資料，所有相關(guān)分析都用Spearman和Pearson，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果:
　　1、OPN在骨肉瘤中表達(dá)陽性率為76.7％，在骨軟骨瘤中為22.2％，二者間有顯著性差異。通過對OPN與骨肉瘤臨床病理特征相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示OPN的表達(dá)水平主要與肺轉(zhuǎn)移以及臨床的分期的相關(guān)性較為明顯，而與

9、病人的年齡、性別以及病例分型無關(guān)。OPN的表達(dá)水平會隨著臨床分期程度的增加以及肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生而增高，組間有顯著性差異。利用單因素分析發(fā)現(xiàn)有較多因素與骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，例如:ALP水平、新輔助化療、臨床分期、OPN以及腫瘤體積等。在此基礎(chǔ)上利用多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)臨床分期和新輔助化療是兩個有統(tǒng)計學(xué)意義的獨立因素。由此構(gòu)建了Logistic回歸方程。OPN mRNA在骨肉瘤中高表達(dá)，在正常骨組織中低表達(dá)，兩者OPN mRNA表達(dá)量有顯著性差

10、異。
　　2、RT-PCR和Western blot結(jié)果證實MG-63細(xì)胞中OPN高表達(dá)，抗OPN特異性抗體作用于MG-63細(xì)胞系結(jié)果顯示，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)無明顯改變;隨著抗OPN特異性抗體劑量的增加和作用時間的延長，MG-63細(xì)胞中OPN mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)。MTT結(jié)果提示，隨著抗OPN特異性抗體劑量增加和作用時間延長，MG-63細(xì)胞的增殖抑制表現(xiàn)出劑量依賴性和時間依賴性。平板克隆形成實驗結(jié)果顯示抗OPN特異性抗體明顯

11、抑制細(xì)胞克隆的形成;細(xì)胞劃痕愈合實驗和Transwell實驗的結(jié)果表明，細(xì)胞遷徙能力明顯減弱，侵襲能力明顯下降。
　　3、MTT實驗結(jié)果表明，經(jīng)過OPN特異性抗體處理后的MG63細(xì)胞株對于化療藥物更加敏感，具有明顯的劑量依賴性和時間依賴性。此外，實驗數(shù)據(jù)表明在同等條件下，化療藥物對于細(xì)胞的生長抑制效果與是否經(jīng)過抗體處理具有顯著性差異。說明抗OPN特異性抗體作用下化療藥物對MG-63細(xì)胞的敏感性升高。啟示抗OPN特異性抗體本身可優(yōu)化

12、化療藥物對于骨肉瘤的治療效果。
　　4、CTG實驗結(jié)果顯示，下調(diào)Cdc20后細(xì)胞的增殖減弱。流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)下調(diào)Cdc20后細(xì)胞的凋亡增加，細(xì)胞周期被阻止在G2/M期。劃痕實驗和侵襲實驗結(jié)果表明下調(diào)Cdc20后骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲力減弱。相反，過表達(dá)Cdc20后，骨肉瘤細(xì)胞的生長加快，凋亡減少，劃痕愈合加快，細(xì)胞的侵襲力加強(qiáng)。提示Cdc20在骨肉瘤中發(fā)揮癌基因的作用。
　　結(jié)論:
　　1、OPN在骨肉瘤中高表達(dá)，表

13、明OPN與骨肉瘤的惡性生物學(xué)行為相關(guān)，可能是判斷骨肉瘤惡性程度及預(yù)后的指標(biāo)，提示可作為骨肉瘤轉(zhuǎn)移的治療標(biāo)靶。多因素回歸分析結(jié)果顯示OPN基因可能通過多種信號通路調(diào)控惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移。OPN基因可作為新指標(biāo)用于預(yù)估腫瘤的預(yù)后以及監(jiān)測骨肉瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。
　　2、抗OPN特異性抗體可以下調(diào)MG-63細(xì)胞中OPN表達(dá)。平板克隆、劃痕實驗、侵襲實驗結(jié)果表明，抗OPN特異性抗體可能通過下調(diào)MG-63細(xì)胞中OPN的表達(dá)，發(fā)揮抑制骨肉瘤侵襲、轉(zhuǎn)移

14、的作用。以上提示對OPN的干擾可成為骨肉瘤轉(zhuǎn)移治療的新途徑。
　　3、抗OPN特異性抗體通過下調(diào)OPN，可顯著提升化療藥物對于MG-63細(xì)胞系增殖的抑制水平，因此可作為骨肉瘤化療的新途徑，但其機(jī)制還需繼續(xù)探索。抗OPN特異性抗體可能會成為一種有前景骨肉瘤治療的新途徑，將會發(fā)揮巨大的臨床應(yīng)用價值。
　　4、Cdc20敲除可以抑制骨肉瘤細(xì)胞生長、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和周期阻滯、減弱細(xì)胞侵襲。敲低Cdc20后Bim和p21蛋白水平升高。過