甜瓜ACO基因家族成員的鑒定及CmACO7和CmACO8基因的克隆.pdf

1、甜瓜(Cucumis melo L.)屬于葫蘆科，是全世界廣泛栽培的水果作物，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。甜瓜豐富的種質(zhì)資源以及2012年甜瓜全基因組測(cè)序的完成，使得甜瓜成為除番茄之外的另一種研究果實(shí)發(fā)育成熟的模式植物。乙烯對(duì)呼吸躍變型果實(shí)的成熟起到重要的調(diào)控作用，ACC氧化酶(ACO)是乙烯生物合成途徑中的最后一個(gè)限速酶。本研究對(duì)甜瓜ACO基因家族進(jìn)行了全基因組分析，根據(jù)甜瓜轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果選擇候選基因，進(jìn)行克隆并構(gòu)建基因的超表達(dá)和CRIS

2、PR/Cas9編輯載體，通過(guò)子房注射法轉(zhuǎn)化甜瓜。主要研究結(jié)果如下:
　　1)本研究從甜瓜全基因組鑒定得到了9個(gè)ACO基因，分別命名為CmACO1-CmACO9，其中CmACO2基因存在可變剪接現(xiàn)象，可編碼3種mRNA。甜瓜ACO基因家族分為2個(gè)亞家族，9個(gè)ACO蛋白序列同源性為19.95％-75.54％，同組蛋白氨基酸序列同源性均在40％以上，組間蛋白的同源性?xún)H為20％左右。甜瓜ACO基因家族與其他物種ACO基因的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

3、顯示，CmACO1與CsACO3、CmACO3與CsACO2、CmACO6與CsACO1同源性最高。
　　2)根據(jù)兩個(gè)不同時(shí)期甜瓜中果肉樣品轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，選取2個(gè)上調(diào)的差異表達(dá)基因進(jìn)行qPCR檢測(cè)，qPCR檢測(cè)結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果基本一致，均在成熟期表達(dá)量上升，選定CmACO7、CmACO8作為候選基因。
　　3)從甜瓜中克隆得到了CmACO7、CmACO8基因cDNA，長(zhǎng)度分別為1191bp、1131bp，分別編碼396

4、、376個(gè)氨基酸，對(duì)兩個(gè)蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明兩個(gè)蛋白的結(jié)構(gòu)域包括DIOX_N和20G-Fe_ⅡOxy，均為親水蛋白;無(wú)信號(hào)肽，均為非分泌蛋白;無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，均不屬于跨膜蛋白。
　　4)成功構(gòu)建了CmACO7、CmACO8基因的超表達(dá)載體pPZP221-CmACO7、pPZP221-CmACO8和編輯載體pCRI-CmACO7、pCRI-CmACO8并通過(guò)子房注射法轉(zhuǎn)化甜瓜，對(duì)T1代植株胚根進(jìn)行PCR檢測(cè)，陽(yáng)性率分別為21