糖尿病大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR4的表達(dá)及對(duì)LPS反應(yīng)性的研究.pdf

1、目的： TOLL樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面的病原模式識(shí)別受體之一，在天然免疫和獲得性免疫中起到了橋梁的作用。鑒于TLRs在免疫學(xué)，分子生物學(xué)以及臨床研究中的重要意義，自發(fā)現(xiàn)至今，一直備受關(guān)注，近期TLRs信號(hào)傳導(dǎo)途徑在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中所起的作用成為研究的熱點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)糖尿病患者單核細(xì)胞中TLR2，TLR4的表達(dá)增加，但其升高的具體意義尚存在爭(zhēng)議。肺泡巨噬細(xì)胞在

2、清除吸入性抗原及致病微生物方面等都具有重要的作用，故以肺泡巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象觀(guān)察脂多糖刺激下TLR4在正常大鼠及糖尿病大鼠肺泡巨噬細(xì)胞表達(dá)的變化，探討糖尿病機(jī)體免疫防御能力變化的發(fā)生機(jī)制。 材料與方法： 1、動(dòng)物模型制備及分組 健康雄性Wistar大鼠32只，SPF級(jí)，鼠齡12周，體重(200±20)克，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室。隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組(A組，n=8)，糖尿病組(B組，n＝8)，正常+LPS組

3、(C組，n=8)，糖尿病+LPS組(D組，n＝8)。糖尿病組一次性腹腔注射鏈脲佐菌素60mg/kg體重，對(duì)照組注射同等劑量枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖溶液，72小時(shí)后隨機(jī)血糖≥16.67mmol/L為復(fù)制糖尿病模型成功。 2、肺泡巨噬細(xì)胞的獲取與培養(yǎng) BALF離心后沉淀細(xì)胞加入含10％小牛血清、10萬(wàn)單位/L青霉素、10萬(wàn)單位/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液，放入事先放有蓋玻片的60mm培養(yǎng)皿中，充分混勻后在37℃，5％CO

4、2，飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2小時(shí)，使巨噬細(xì)胞貼壁，棄去非貼壁細(xì)胞。 3、免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀(guān)察ILR4在各組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞表達(dá)的變化 將貼有巨噬細(xì)胞的蓋玻片用4％多聚甲醛固定30分鐘，PBS洗片后采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色SABC法染色。各組切片用Meta-Morph/DP10/BX41顯微圖像分析系統(tǒng)測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞單位面積平均光密度值。 4、RT-PCR檢測(cè)AMs中TLR4的表達(dá) 將Tripure試劑1ml加入

5、培養(yǎng)皿中，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。電泳后取膠置凝膠成像系統(tǒng)中拍照，結(jié)果掃入計(jì)算機(jī)并分別進(jìn)行處理。 5、Western Blot方法檢測(cè)TLR4蛋白表達(dá)水平 AMs中蛋白提取和定量后，取等量樣品進(jìn)行聚丙烯凝膠電泳，經(jīng)一抗和二抗孵育后顯色，GDS800凝膠自動(dòng)成像儀掃描成像，V2.03分析軟件測(cè)定積分光密度值。 6、統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)

6、據(jù)用-x±s表示，各組間指標(biāo)比較用雙因素雙水平析因分析，P<0，05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果 正常組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞可見(jiàn)弱的TLR4表達(dá)，以胞漿及胞膜為主呈較淡的棕黃色改變；糖尿病組細(xì)胞TLR4在上述部位的表達(dá)增多，在胞漿及胞膜呈金黃色改變；正常+脂多糖組及糖尿病+脂多糖組細(xì)胞的胞漿及胞膜呈深棕黃色改變，且可見(jiàn)部分細(xì)胞胞漿淡染、腫脹，部分細(xì)胞胞核形態(tài)不規(guī)則，部分細(xì)胞變性壞死。

7、 2、RT-PCR結(jié)果 與正常組相比，糖尿病組、正常+脂多糖組、糖尿病+脂多糖組的TLR4 mRNA表達(dá)水平依次增加，差異顯著。 3、Western Blot分析結(jié)果 糖尿病組TLR4表達(dá)較正常組明顯增加，差異顯著(P<0.01)；糖尿病+LPS組TLR4表達(dá)較正常+LPS組增加更為顯著(P<0.01)。 結(jié)論： 1、糖尿病大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR4表達(dá)較正常大鼠明顯增高，提示糖尿病機(jī)體處于促炎癥